胡 敏，歐陽(yáng)軍，胡 蓉，杜華英，羅秋水，熊建華*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省安遠(yuǎn)縣果然食品有限公司，江西 安遠(yuǎn) 342100)

色素賦予食品繽紛的色澤韻味，給人以美的享受和味道的聯(lián)想，現(xiàn)代食品工業(yè)使用的色素基本上都是合成色素，合成色素主要以煤焦油中分離的苯胺為原料加工制成，有不同程度的危害作用，情況嚴(yán)重可致癌、致畸、致突變，因此天然色素的獲取和使用越來越受到人們的關(guān)注[1-2]。

花青素(anthocyanidin),又稱花色素，是一種天然的水溶性色素，具有抗氧化，抗突變，抗腫瘤，抗疲勞，治療心腦血管疾病等多種生理作用[3-4]。天然花青素雖在甘薯、葡萄、藍(lán)莓、茄子等食物中廣泛存在，但由于含量較低且食物價(jià)格較高等原因，至今在我國(guó)開發(fā)利用的相對(duì)較少，不能滿足市場(chǎng)的需求[5]。百香果(PassifloraeduliaSims)，又名雞蛋果，在氣候溫暖的海南、廣西、江西贛州等地區(qū)具有較好的適應(yīng)性[6-8]，產(chǎn)量正在逐年提高，百香果的消費(fèi)主要以鮮果和果汁形式，產(chǎn)地及果汁加工廠有大量百香果果皮廢棄物，百香果外果皮富含花青素[9]，本試驗(yàn)以紫果百香果為原料研究其外果皮中花青素的提取工藝及穩(wěn)定性，為百香果資源的開發(fā)利用和天然花青素的獲取、應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

試驗(yàn)材料：百香果紫香一號(hào)，江西果然食品有限公司提供。選擇成熟、色澤紫紅的百香果果皮，洗凈晾干，剔除內(nèi)果皮得到堅(jiān)硬的外果皮，冷凍干燥，打成粉，過40目篩，干燥器中保藏，備用。

主要試劑：無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、山梨酸、苯甲酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：紫外-可見分光光度計(jì)(SPECORD 200)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-3000)，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；恒溫水浴鍋(HH-4)，國(guó)華電器有限公司；冷凍干燥機(jī)(FD-1D-50)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超低溫冰箱(902-ULTS)，美國(guó)賽默飛。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 百香果外果皮中花青素的提取及測(cè)定 稱取1 g百香果外果皮粉末樣品，加入一定料液比的乙醇溶液，回流提取一定時(shí)間，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，取一定濃縮液，用緩沖溶液稀釋后測(cè)定吸光度A[10]，根據(jù)公式(1)、(2)計(jì)算花青素的提取率。

溶液花色苷含量(mg/L)=A×MW×DF×1000/ε×1

(1)

花色苷提取率(mg/g)=C×V/m

(2)

式(1)中，A為吸光度；MW為花色苷相對(duì)分子質(zhì)量(465)；DF為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)(35 481)；1為比色皿光程(1 cm)，以 3′甲花翠素-3-葡萄糖苷計(jì)；式(2)中，C為溶液花色苷質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為溶液體積(mL)；m表示百香果果殼質(zhì)量(g)。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 選擇單因素試驗(yàn)因素及水平范圍為pH 1～6，料液比1∶15～1∶40，提取時(shí)間1～6 h，提取溫度10～60 ℃和乙醇濃度40%～90%。探究百香果外果皮中花青素的最佳單因素提取條件。

1.2.3 提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法[11]，優(yōu)化百香果外果皮花青素的提取工藝。根據(jù)單因素的結(jié)果分析，選擇提取pH為2，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度為響應(yīng)變量因子，以A、B、C、D表示。試驗(yàn)因素和水平編碼設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表

1.2.4 花青素穩(wěn)定性研究 將花青素提取液置于不同光線、不同溫度、不同pH環(huán)境中，或添加氧化劑、還原劑、防腐劑、漂白劑、護(hù)色劑、不同離子進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定，每隔一定時(shí)間測(cè)其吸收光譜，觀察吸收度和最大吸收波長(zhǎng)的變化，每組試驗(yàn)重復(fù)3次并與相應(yīng)的空白進(jìn)行比較對(duì)照。所有添加劑的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)與添加劑量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)百香果外果皮花青素提取效果的影響結(jié)果

由圖1a可知，花青素在510～530 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有吸收，且提取效果受pH的影響較大，當(dāng)樣品提取液pH為1、2時(shí)，花青素吸光度較強(qiáng)，提取效果較好，pH為3、4、5時(shí)，色素溶液吸光度降低較多，提取效果降低，在扣除基線的影響下，pH=1時(shí)，提取花青素效果最好，提取率為2.881 mg/g，但pH=1的酸性太強(qiáng)，花青素天然結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，pH=2時(shí)，提取率為2.877 mg/g，兩者提取效果相差不大，結(jié)合實(shí)際情況選擇pH=2為最佳提取酸度。由圖1b可知，當(dāng)乙醇濃度為80%～90%時(shí)，百香果果殼花青素提取率基本穩(wěn)定。由圖1c可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，花青素提取率不斷增大，當(dāng)溫度超過30 ℃時(shí)，提取率隨溫度的升高反而呈下降趨勢(shì)，可能因?yàn)闇囟冗^高會(huì)使花青素的穩(wěn)定性受到影響，結(jié)構(gòu)改變所致，因此最佳提取溫度為30 ℃左右。由圖1d可知，在一定的條件下，隨著時(shí)間增加，百香果外果皮花青素提取率隨之增加，當(dāng)時(shí)間為4 h時(shí)，提取率到達(dá)最大，之后提取率降低，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間加熱使色素氧化所致，因此選取4 h為最佳提取時(shí)間。由圖1e可知，隨著料液比的增加，百香果外果皮中物質(zhì)在溶劑中溶解量增加，提取率不斷增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時(shí)，溶質(zhì)在溶劑的溶解達(dá)到飽和[12]，提取率達(dá)到最大值2.985 mg/g，因此最佳料液比1∶25。

圖1 pH、乙醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比對(duì)百香果外果皮花青素的提取率的影響Fig.1 Effects of pH,ethanol concentration,temperature,time,and solid-to-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanidin in passion fruit outer skin

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

按照單因素試驗(yàn)，選擇提取pH為2，采取4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以料液比Z1=(A-25)/5，提取溫度Z2=(B-30)/10，提取時(shí)間Z3=(C-4)/1，乙醇濃度Z4=(D-80)/10為自變量，以百香果外果皮中花青素提取率Y為響應(yīng)值，對(duì)提取花青素的工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2。

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)百香果外果皮中色素提取的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到擬合方程：Y=3.05+0.043Z1+0.081Z2-0.031Z3+0.060Z4+0.050Z1Z2-0.13Z1Z3+ 0.030Z1Z4-0.094Z2Z3+0.020Z2Z4+0.040Z3Z4-0.20Z12-0.16Z22-0.18Z32-0.15Z42?；貧w方差分析見表3。

表2 試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表3分析可知，該回歸方程的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)影響極顯著，表明該模型不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，是二次拋物線的關(guān)系[13]，交互項(xiàng)Z2Z4不顯著，說明兩者之間相互影響不大，其余交互項(xiàng)顯著或極顯著，表明相互之間影響極大。各因素對(duì)花青素提取效果影響的顯著性與花青素易氧化的優(yōu)越抗氧化性能相吻合，由F值可知，影響百香果外果皮花素提取率由大到小的順序依次是提取溫度、乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間。

整體模型P<0.01，表明該二次方程模型極顯著。R2為0.991 2，說明該模型響應(yīng)值的變化99.12%來自所選因變量，因此，該試驗(yàn)方法能較好地反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果的可行性，失擬項(xiàng)P>0.05不顯著，說明該模型擬合性好，可對(duì)最佳提取條件進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)Box-Behnken軟件分析得到百香果外果皮花青素最佳提取條件：料液比1∶26.28，溫度33.84 ℃，時(shí)間3.74 h，乙醇濃度82.18%?？紤]到試驗(yàn)操作條件更可行，將花青素最佳工藝調(diào)整為：料液比1∶26，提取溫度34 ℃，提取時(shí)間3.8 h，乙醇濃度82%。

響應(yīng)值對(duì)各單因素所組成的三維圖，即為響應(yīng)面圖，按照二次回歸方程，作出響應(yīng)面曲面圖和等高圖(圖2A～F)，等高線形狀反映出交互作用的顯著差異性。圖2E等高線幾乎接近圓形，表明溫度與乙醇濃度交互作用不顯著，圖2A～D、圖2F等高線圖形為橢圓形，表明相互之間交互作用顯著，與表3結(jié)果相符。

表3 回歸分析結(jié)果

A:(料液比和溫度)響應(yīng)面圖和等高圖 A:Interaction and solid-liquid ratio and temperature response surface and contour map

B:(料液比和時(shí)間)響應(yīng)面圖和等高圖B:The material liquid ratio and time interaction response surface and contour map

C:(料液比和乙醇濃度)響應(yīng)面圖和等高圖C:The material liquid ratio and ethanol concentration interaction response surface and contour map

D:(溫度和時(shí)間)響應(yīng)面圖和等高圖D:Temperature and time interaction response surface and contour map

E:(溫度和乙醇濃度)響應(yīng)面圖和等高線圖E:The response surface temperature and ethanol concentration interaction diagram and contour map

F:(時(shí)間和乙醇濃度)響應(yīng)面圖和等高線圖F:Time and ethanol concentration interaction response surface and contour map圖2 各兩因素交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surfaces and contour plots showing the interactive effects of solid-liquid ratio，temperature,ethanol concentration and time on the anthocyanin extraction rate from passion fruit

2.3 百香果外果皮中花青素最佳提取工藝的確定和驗(yàn)證

在選定的優(yōu)化條件下，對(duì)花青素的提取進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表4，花青素實(shí)際提取率為3.125 mg/g，與預(yù)測(cè)提取率3.080 mg/g相對(duì)誤差僅為1.402%，因此，該提取工藝穩(wěn)定，可用于實(shí)際操作。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.4 穩(wěn)定性影響結(jié)果

2.4.1 光照對(duì)花青素穩(wěn)定性影響分析 由下列圖3a、圖3b、圖3c可知，不同的光照對(duì)花青素影響不同，室內(nèi)和避光時(shí)影響較小，吸光度隨著光照天數(shù)增加略微下降，在室外(11月份)太陽(yáng)光下花青素吸光度下降較快，第6天吸光度下降了15%，第12天時(shí)下降了91%，吸收峰基本消失。所以太陽(yáng)光對(duì)花青素穩(wěn)定性影響很大，保存時(shí)應(yīng)盡量避免強(qiáng)光的直射。

圖3 不同環(huán)境對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of different environments on the stability of anthocyanins

2.4.2 溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性影響分析 由圖3d、表5可知，在50～100 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度升高，花青素的最大吸光度下降的速度越快，至200 ℃時(shí)吸光度大幅度下降，最大吸收波長(zhǎng)甚至產(chǎn)生紅移，所以色素在高溫條件下穩(wěn)定性較差，結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生改變，使用該色素應(yīng)該避免高溫加熱工藝和高溫儲(chǔ)藏。

2.4.3 氧化劑和還原劑對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響分析 由圖4、5，表6可知，加入Vc后體系的吸光度降低，而且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度降低的越多；體系隨濃度的增加，吸光度值下降越快，濃度為0.2%時(shí)，Vc的吸光度降低了19%左右，濃度為1.0%時(shí)，吸光度降低了23%左右，濃度為2.0%時(shí)，吸光度降低了25%左右。H2O2對(duì)花青素的消色效果相較Vc更大，最終最大吸收峰會(huì)消失，且H2O2的濃度越大，吸收峰消失時(shí)間就越短，0.2%H2O2吸收峰消失耗時(shí)6 h，1.0%H2O2吸收峰消失耗時(shí)3 h，2.0%H2O2吸收峰消失耗時(shí)2 h。因此，儲(chǔ)存和使用花青素時(shí)，應(yīng)該盡量避免接觸還原劑或氧化劑，尤其是氧化劑。

表5 溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響

圖4 Vc對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of Vc on the stability of anthocyanin

圖5 H2O2 濃度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of H2O2 on the stability of anthocyanin

時(shí)間/h TimeVc0.2%1.0%2.0%H2O20.2%1.0%2.0%00.624 70.624 70.624 70.624 70.624 70.624 710.484 60.513 20.521 90.385 00.167 70.261 020.505 70.500 90.511 50.298 40.265 80.261 830.505 70.478 80.466 60.231 10.258 10.256 4

2.4.4 防腐劑對(duì)花青素的穩(wěn)定性影響分析 由圖6可知，山梨酸鉀和苯甲酸鈉對(duì)花青素的影響很小，即使是用不同濃度的山梨酸鉀和苯甲酸鈉對(duì)色素溶液也幾乎是無任何影響。

圖6 防腐劑對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of preservatives on the stability of anthocyanins

圖7 漂白劑對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of bleaching agents on the stability of anthocyanins

2.4.5 漂白劑對(duì)花青素的穩(wěn)定性影響分析 由圖7可知，NaHSO3對(duì)花青素溶液有減色效應(yīng)。減色效果是隨NaHSO3的濃度增加而越明顯，加入0.1%NaHSO3后，吸光度的波峰已經(jīng)消失，故花青素溶液應(yīng)避免與漂白劑NaHSO3接觸。

2.4.6 發(fā)色劑對(duì)花青素穩(wěn)定性影響分析 由圖8可知，NaNO2對(duì)色素溶液有減色效應(yīng)，減色效果由大到小依次為：0.50% NaNO2、0.25% NaNO2、0.10% NaNO2和0.05% NaNO2，色素溶液中加入NaNO2后，溶液的最大吸收波長(zhǎng)消失。色素濃液的顏色也逐漸由鮮紅色慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色濃液，所以NaNO2對(duì)色素溶液影響很大，要避免色素溶液和NO2-接觸。

2.4.7 pH對(duì)花青素的穩(wěn)定性影響分析 將提取的花青素溶液至不同pH并掃描其吸光度，由圖9可以看出，花青素溶液穩(wěn)定性隨pH值的變化趨勢(shì)與提取時(shí)一致，由于花青素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隨pH值增大吸光度下降，并且在酸性環(huán)境中呈亮紅色，pH接近5時(shí)，漸有藍(lán)色摻入，最大吸光波長(zhǎng)紅移，因此，花青素比較適用于酸性食品中。

圖8 發(fā)色劑對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of color fixative on pigment stability

圖9 pH對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on the stability of anthocyanin

2.4.8 不同金屬離子對(duì)花青素的穩(wěn)定性影響分析 由表7可以看出，Al3 +、Fe3 +、Fe2+、Cu2 +對(duì)花青素溶液有增色效果，其中Al3 +的增色效果最為明顯；Fe3 +增色效果其次，隨著Fe3 +濃度的增加，吸光度增加，但最后花青素溶液會(huì)因?yàn)楦邼舛菷e3 +產(chǎn)生沉淀；再次是Fe2+、Cu2+濃度較低時(shí)增色效果不明顯，濃度較大時(shí)，對(duì)花青素的溶液有增色作用； 不同濃度Ca2 +、Mg2 +、Na+、K+對(duì)花青素溶液的穩(wěn)定性基本無影響，故該花青素溶液應(yīng)該避免與鐵制品、鋁制品、銅制品接觸。

表7 不同金屬離子對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)以紫果百香果外果皮為原料，乙醇溶液為提取劑，通過采用單因素初篩和Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)，得出回歸方程：Y=3.05+0.043Z1+0.081Z2-0.031Z3+0.060Z4+0.050Z1Z2-0.13Z1Z3+0.030Z1Z4-0.094Z2Z3+0.020Z2Z4+0.040Z3Z4-0.20Z12-0.16Z22-0.18Z32-0.15Z42，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)影響極顯著，交互項(xiàng)Z2Z4不顯著，其余顯著，說明該方程為二次拋物線。pH=2，料液比1∶26，溫度34 ℃，時(shí)間3.8 h和乙醇濃度82%為最佳提取條件。

百香果外果皮花青素的耐強(qiáng)光和高溫能力較差，200 ℃時(shí)最大吸收波長(zhǎng)甚至產(chǎn)生紅移現(xiàn)象；NaHSO3、NaNO2、還原劑Vc和氧化劑H2O2對(duì)色素溶液有消色作用，NaHSO3、NaNO2能使色素溶液完全消色，還原劑Vc和氧化劑H2O2使色素溶液部分消色；Al3 +、Fe3 +、Fe2+、Cu2 +對(duì)色素有增色作用，Al3 +增色作用最強(qiáng)，而Fe3 +其次，高濃度時(shí)甚至產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，F(xiàn)e2+再次，Cu2 +只有濃度較大時(shí)才會(huì)有較明顯的增色作用，金屬離子Na+、K+、Mg2 +、Ca2 +對(duì)花青素影響不大；pH值對(duì)花青素影響較大，pH在1、2、3、4的花青素溶液是呈鮮亮的紅色，pH接近5時(shí)，色素溶液開始由亮紅漸變?yōu)樗{(lán)綠色；不同濃度的防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉對(duì)色素溶液幾乎是無任何影響。研究結(jié)果表明，天然百香果花青素穩(wěn)定性較差，可受到較多因素的影響，作為著色劑應(yīng)用到食品、醫(yī)藥及保健品等產(chǎn)品中應(yīng)注意使用和保存條件。