高效液相色譜法測定冬凌草甲素脂質體的含量

王知平

（山西衛(wèi)生健康職業(yè)學院，山西太原030012）

冬凌草甲素（oridonin）屬于貝殼杉烯二萜類化合物，是從唇形科（Labiatae）香茶菜屬（Isodon）植物冬凌草中提取出的主要成分，該物質具有抗癌活性［1-2］。由于冬凌草甲素味苦，水溶性、脂溶性較差，不適合直接制備成注射液或者乳劑，且制備片劑的生物利用度較低。有文獻報道，采用加入有機溶劑和表面活性劑的方法可增加冬凌草甲素的溶解度制備成靜脈注射劑，但此種方法改進容易引起不良反應［3］。通過對冬凌草甲素的性質進行分析，決定將其制為脂質體，增加溶解度，提高藥物的生物利用度。文獻報道，多采用薄層色譜法、反相高效液相色譜法、高效毛細管電泳法等方法測定冬凌草甲素的含量。本文采用高效液相色譜法（HPLC）測定冬凌草甲素及其自制脂質體的含量，方法簡便，結果準確，為其脂質體的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1260系列高效液相色譜系統（美國Agilent公司，G1314B DAD檢測器，G1311C四元泵，G1329B標準型自動進樣器，G1316A柱溫箱）。冬凌草甲素原料藥（南京邦諾生物科技有限公司，純度＞98.0%）；冬凌草甲素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111721-200501，純度＞98.5%）；乙腈、甲醇均為色譜純（山東禹王實業(yè)有限公司），其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（55∶45）；柱溫：30 ℃；檢測波長：241 nm；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL。理論板數按冬凌草甲素峰計不低于2 000，冬凌草甲素與雜質峰之間的分離度應符合要求R＞1.5，冬凌草甲素峰的拖尾因子小于 1.5。

在此色譜條件下，冬凌甲素對照品及冬凌甲素鈉脂質體色譜圖見圖1。

圖1 冬凌甲素對照品、冬凌甲素鈉脂質體和空白脂質體色譜圖

2.2 線性試驗

對照品貯備液的配制：精密稱取冬凌草甲素對照品10 mg，置于50 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至50 mL刻度線，搖勻，即得。

對照品溶液的配制：取6個洗凈的10 mL容量瓶，分別精密移取對照品貯備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于容量瓶中，加流動相稀釋至10 mL刻度線，搖勻，得到濃度分別為10 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，60 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL 的系列對照品溶液，按照“2.1”項下條件進樣，記錄色譜圖。橫坐標為冬凌草甲素的量（μg），縱坐標為冬凌草甲素的峰面積（A），繪制標準曲線進行回歸，回歸方程為：A=22.18C+6.15，r=0.999 5。結果表明，冬凌草甲素在10～100 μg/mL濃度范圍內，峰面積與濃度線性關系良好。

2.3 溶液穩(wěn)定性試驗

取6份濃度為40 μg/mL的對照品溶液，在室溫下放置，分別于 0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 進樣 20 μL，得到色譜圖，記錄峰面積。結果表明：冬凌草甲素峰面積的RSD為0.72%，表明樣品溶液在12 h之內穩(wěn)定。

2.4 精密度試驗

精密配制濃度為 10 μg/mL，40 μg/mL，80 μg/mL的對照品溶液各3份，同一天內早、中、晚各進樣分析兩次，記錄色譜圖，代入標準曲線中計算藥物濃度，計算日間精密度、日內精密度和準確度。結果表明，日內、日間精密度的RSD分別為0.8%和1.2%，準確度在90%～110%之間（測定的平均藥物濃度與實際濃度的比值）。

2.5 重復性實驗

精密量取冬凌草甲素脂質體6份，加入甲醇溶解超聲10 min破乳，使溶液澄清，流動相定容，并搖勻，配制成一定濃度的溶液，取20 μL進樣，并記錄色譜圖，將峰面積帶入標準曲線中計算得到冬凌草甲素脂質體中藥物的含量。結果顯示，冬凌草甲素的含量RSD為1.92%，表明此方法重復性良好。

2.6 回收率試驗

精密量取空白脂質體1.0 mL共9份，置于10 mL的容量瓶中，分別加入冬凌草甲素對照品，配成相當于樣品含量的80%，100%，120%低、中、高濃度的樣品溶液各三份。將上述溶液，加入適量甲醇溶解超聲破乳，進樣，得到色譜圖，記錄峰面積，代入回歸方程，得到冬凌草甲素脂質體中藥物的含量。再將測得量與加入量相比得到冬凌草甲素的加樣回收率，結果顯示低、中、高三個濃度的平均回收率分別為100.3%，99.9%，99.5%，RSD分別為1.2%，0.58%，0.56%。平均回收率為99.9%，平均RSD為0.77%。

2.7 冬凌草甲素脂質體包封率的測定

包封率是指包封于脂質體內的藥物量占脂質體混懸液藥物總量的比例。

洗脫液用PBS水溶液，配制方法：取磷酸二氫鉀6.8 g，純凈水稀釋至1 000 mL，采用NaOH溶液調節(jié)pH至6.5。

取自制冬凌草甲素脂質體樣品3批（批號為20170504，20170511，20170515），每批取 3 份，分別上樣于已預先用生理鹽水平衡好的Sephadex-G50凝膠柱，洗脫液以0.5 mL/min的流速洗脫，將藥物洗脫液分別收集在10 mL的容量瓶中，加甲醇超聲破乳，流動相定容，取20 μL進樣，得到色譜圖，記錄峰面積，代入回歸方程，計算得到溶液中冬凌草甲素的質量m1。

精密吸取同樣量未過柱的冬凌草甲素脂質體三批（批號為 20170504，20170511，20170515），每批取3份，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解超聲破乳，流動相定容，進樣，得到色譜圖，記錄峰面積，代入回歸方程，計算藥物質量，取平均值，得總藥物質量m1。計算包封率，其包封率分別為95.82%、94.39%、94.75%，平均包封率為94.99%。

3 討論

本研究中，破乳影響藥物的釋放，影響藥物包封率的測定，進而影響脂質體質量的好壞，而破乳選擇的方法是超聲，因此需要通過選擇合適的超聲時間進行破乳［2］。利用紫外可見分光光度計對冬凌草甲素和脂質體中輔料在200～400 nm波長下掃描，發(fā)現冬凌草甲素在241 nm附近有最大吸收，因此選擇241 nm作為檢測波長。

有關包封率的測定大多采用離心超濾法、凝膠過濾法、透析法、葡聚糖凝膠柱層析法等。在前期研究中，將這幾種方法都做了比較，4種方法測得結果葡聚糖凝膠柱層析法的結果最好，因此選擇了比較經典的葡聚糖凝膠柱層析法測定［4］。

本文建立高效液相色譜法測定自制冬凌草甲素脂質體中冬凌草甲素的含量，方法簡便，容易操作，測定結果準確，包封率測定也符合要求。