李偉偉，史鴻志，殷秀榮，閆婭妮，馬波

(河北省秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學科，秦皇島 066004)

世界范圍內(nèi)已婚孕齡夫婦存在生育困難的發(fā)病率高達10%～15%，男女因素大約各占50%[1-2]。輔助生殖技術(shù)已經(jīng)成為治療不孕不育癥的重要手段。目前普遍認為精子功能缺陷是造成男性不育的最主要原因之一。精子特異性鈣離子通道(CatSper)共有4個成員CatSper1、CatSper2、CatSper3和CatSper4，CatSper1、CatSper2位于精子尾部，主要對精子鞭毛起作用，在增強精子運動、受能、超活化等方面起作用；CatSper3、CatSper4位于精子頭部，主要在頂體反應(yīng)過程中起作用。CatSper是目前公認的精子細胞上最重要的鈣離子通道。近年來有研究表明，CatSper2與男性不育存在相關(guān)性[3]，但目前關(guān)于CatSper2的研究大多集中在結(jié)構(gòu)和功能方面[4-7]，尚缺少CatSper與輔助生殖技術(shù)關(guān)系的研究。本文旨在通過研究CatSper2與體外受精(IVF)的受精率、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的關(guān)系，從而為改善不育癥患者的助孕結(jié)局提供一定參考。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2016年4月至2018年2月于我院生殖中心進行常規(guī)IVF治療的112例夫妻雙方的臨床資料，納入標準：女方年齡24～37歲，男方年齡25～40歲；男方無吸煙史、酗酒史、放射線暴露史；夫妻雙方染色體均正常；無遺傳病家族史，無近期泌尿生殖系統(tǒng)感染；有胚胎形成，均為首次行IVF。

分組情況：(1)取卵日男方取精完畢后，先行精液常規(guī)分析，根據(jù)精液情況分為兩組：精液正常組(46例)：精子濃度>15×106/ml、前向運動精子>32%、正常精子形態(tài)>4%；少弱精子組(66例)：精子濃度<15×106/ml、前向運動精子<32%、正常精子形態(tài)<4%。各組納入標準：精液正常組均為女方單純輸卵管性不孕；少弱精子組中女方無其他不孕相關(guān)疾病。(2)根據(jù)取卵日男方精液的濃度將所有研究對象分為兩組：高濃度組(76例)：精子濃度>15×106/ml；低濃度組(36例)：5×106/ml<精子濃度<15×106/ml。(3)根據(jù)受精率將所有研究對象分為3組：A組(25例)：受精率<30%；B組(37例)：30%<受精率<60%；C組(50例)：受精率>60%。(4)根據(jù)優(yōu)質(zhì)胚胎率和可利用胚胎率將所有研究對象分為4組：Q1組(67例)：優(yōu)質(zhì)胚胎率>30%；Q2組(45例)：優(yōu)質(zhì)胚胎率<30%；Q3組(66例)：可利用胚胎率>50%；Q4組(46例)可利用胚胎率<50%。(5)將104例新鮮周期移植患者根據(jù)是否獲得臨床妊娠分為兩組：臨床妊娠組42例和未妊娠組56例，另外有6例早期流產(chǎn)患者未納入分組。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)：納入研究的患者均采用常規(guī)促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案COH，達到降調(diào)標準后，應(yīng)用重組人促卵泡激素(Gonal-F，默克雪蘭諾，法國)啟動促排卵。監(jiān)測卵泡直徑以及子宮內(nèi)膜的發(fā)育情況，Gn和GnRH-a種類及劑量的給予根據(jù)卵泡發(fā)育的大小和激素水平進行調(diào)整。當2～3個主導卵泡直徑>18 mm時，停用Gn和GnRH-a；當晚20時注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后經(jīng)陰道超聲引導下取卵[8]，所有研究對象的受精方式均采用IVF。

2.精液常規(guī)分析：將IVF授精后剩余的精子應(yīng)用markler精子計數(shù)板進行常規(guī)分析，項目包括精子的濃度、前向運動精子的百分率以及精子形態(tài)學分析等，指標評價參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版[9]標準。所有精液標本的處理由1名規(guī)范化培訓合格的技術(shù)人員操作，充分混勻精液標本，進行3次計數(shù)，取平均值。形態(tài)學分析采用快速染色方法，參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版進行。

3.精子mRNA提取和逆轉(zhuǎn)錄：取卵日，將液化后的精液緩慢加入密度梯度液上層，500g離心15 min后洗滌沉淀，棄上清；沉淀混勻后輕輕加入裝有0.5 ml培養(yǎng)液的試管底部置培養(yǎng)箱，傾斜45度上游30 min，待授精。授精后剩余的精子PBS洗滌兩次后用于提取mRNA。利用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA。適量的DEPC水溶解RNA沉淀，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量總RNA稀釋后用分光光度計測定OD260/OD280，比值均在1.8～2.0。計算濃度后備用。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購自立陶宛Fermantas公司，操作嚴格按照說明書進行，產(chǎn)物于-70℃保存待用。

精子純化：為了確保所檢測到的mRNA是成熟精子中的mRNA，上游后的精子經(jīng)PBS洗滌后，用0.4%伊紅Y染色30 min后顯微鏡下觀察。純化標準：在顯微鏡下確認無圓形細胞或殘余體。

4.聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增：引物設(shè)計：從Gen Bank查詢CatSper2的mRNA基因序列AF411816，引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件完成，序列如表1。應(yīng)用DNA作為模板，建立25 μl PCR體系：2×Taq酶PCR反應(yīng)混合液12.5 μl，20 μmol/L引物各1.5 μl，模板DNA 2.0 μl，重蒸餾水 7.5 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，降至4℃保溫。擴增片段長度為261 bp。凝膠電泳觀察結(jié)果。用Quantity-one軟件分析，以目的基因與內(nèi)參基因β-actin灰度比值表示目的基因的相對含量。

表1 引物序列

5.觀察指標及判斷標準：精卵共培養(yǎng)18～20 h后觀察雙原核(2PN)情況，受精率=2PN數(shù)/獲卵數(shù)。培養(yǎng)第3天(D3)行胚胎評分，根據(jù)卵裂球的數(shù)量、均勻程度及是否有碎片，按胚胎評分法[10]對D3胚胎進行評分：(1)Ⅰ級胚胎：細胞均勻，形狀規(guī)則，碎片在0～5%之間；(2)Ⅱ級胚胎：細胞大小均勻，形狀略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片在5%～10%之間；(3)Ⅲ級胚胎：細胞大小均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒，碎片在10%～25%之間；(4)Ⅳ級胚胎：細胞大多不均勻，胞質(zhì)可有嚴重顆?，F(xiàn)象，碎片在25%以上。D3優(yōu)質(zhì)胚胎：來源于正常受精卵，受精后D3胚胎細胞數(shù)為7～9個，碎片程度小于10%的胚胎；D3優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%。D3可利用胚胎：受精后D3可移植和冷凍的胚胎總和；D3可利用胚胎率=D3可利用胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%。臨床妊娠的判斷：D3移植1～2枚可利用胚胎，同時給予黃體支持，移植后14 d檢測血清HCG，30 d后B超檢查可見孕囊者診斷為臨床妊娠；臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、精子純化效果

顯微鏡下觀察染色后的精子，并未見圓形細胞或胞質(zhì)殘余體(圖1)，證明所檢測到的mRNA是成熟精子中的mRNA。

優(yōu)選后的精子用0.4%伊紅Y染色30 min后顯微鏡下觀察，未見圓形細胞和殘余體圖1 顯微鏡下精子純化效果(×400)

二、不同活力精子的CatSper2表達水平比較

精液正常組46例(41.1%)和少弱精子組66例(58.9%)的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。精液正常組和少弱精子組前向運動精子百分率分別為(55.7±8.23)%和(24.9±5.62)%，有顯著性差異(P<0.05)；精液正常組的CatSper2表達水平[(1.26±0.23)]顯著高于少弱精子組[(0.54±0.18)](P<0.05)。分析發(fā)現(xiàn)，前向運動精子百分率和CatSper2基因的相對表達量呈顯著性正相關(guān)(r=0.416，P<0.05)(圖2)。

圖2 前向運動精子百分率與CatSper2 mRNA相對表達量的相關(guān)性

三、不同濃度精子CatSper2的表達水平比較

高濃度組和低濃度組的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。高濃度組的CatSper2表達水平為(0.89±0.27)，低濃度組為(0.80±0.20)，組間比較無顯著性差異(P>0.05)。精子不同濃度與CatSper2表達水平相關(guān)性并不顯著(r=0.024，P>0.05)。

四、不同受精情況的CatSper2表達水平比較

A、B、C三組間的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。A、B、C三組CatSper2的相對表達量分別為(0.98±0.05)、(1.00±0.06)及(1.01±0.06)，組間比較無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。受精率與CatSper2的相對表達量相關(guān)性不顯著(r=0.085，P>0.05)(圖4)。

圖3 不同受精率分組的CatSper2表達水平比較

圖4 受精率與CatSper2 mRNA相對表達量的相關(guān)性

五、不同胚胎質(zhì)量CatSper2表達水平比較

Q1、Q2、Q3與Q4組的基礎(chǔ)資料比較均無顯著性差異(P>0.05)。Q1和Q2組CatSper2的相對表達量分別為(0.93±0.07)和(0.90±0.07)，組間比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)；優(yōu)質(zhì)胚胎率與CatSper2的相對表達量相關(guān)性不顯著(r=0.096，P>0.05)。Q3和Q4組CatSper2的相對表達量分別為(0.88±0.12)和(0.92±0.11)，組間比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)；可利用胚胎率與CatSper2的相對表達量相關(guān)性亦不顯著(r=0.028，P>0.05)。

表2 不同胚胎質(zhì)量CatSper2的表達水平(-±s)

六、不同妊娠情況的CatSper2表達水平比較

所有研究對象共112個移植周期，其中新鮮移植104個周期(早期流產(chǎn)6個周期)。臨床妊娠42例(40.4%，42/104)；未妊娠者56例(53.8%，56/104)。臨床妊娠組和未妊娠組的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。臨床妊娠組的CatSper2相對表達量為(1.00±0.05)，未妊娠組為(0.98±0.09)，組間比較無顯著性差異(P>0.05)。妊娠情況與CatSper2表達水平相關(guān)性不明顯(r=0.032，P>0.05)。

討 論

近年來大多研究報道了CatSper1與弱精子癥及男性不育的關(guān)系[11-13]，CatSper2的研究尚少，且都著重于研究CatSper2在與睪丸及精子中的功能及定位等方面[14]，僅有較少的國外學者曾研究CatSper2的表達水平與男性不育的關(guān)系[7]，目前還未有國內(nèi)的學者研究CatSper2的表達水平與助孕妊娠結(jié)局的關(guān)系。本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄 PCR的方法檢測精液正常組和少弱精子組的CatSper2基因的表達情況，進一步確認CatSper2與男性不育的關(guān)系。結(jié)果表明少弱精子癥患者CatSper2的表達明顯低于精液正常組，這個結(jié)果與Avidan等[15]2003年發(fā)現(xiàn)CatSper2基因缺失導致弱畸精子的研究結(jié)果相一致。李紅鋼等[16]通過檢測同一份標本中高、低活力的精子CatSper2和CatSper3的mRNA水平，實驗結(jié)果表明CatSper2和CatSper3檢測可考慮作為男性不育，尤其是弱精子癥病因檢查的靶點。本實驗結(jié)果表明不同精子濃度間的CatSper2表達無顯著性差異，也進一步證實CatSper2可能是弱精子癥的相關(guān)靶基因，與Bhilawadikar等[17]的研究相一致。由于弱精子癥患者的精子中CatSper2表達下降，我們猜想CatSper2可能與精子的活力相關(guān)，這與目前的研究結(jié)果相一致。

本研究嘗試分析CatSper2與輔助生殖過程中相關(guān)指標的相關(guān)性，如果CatSper2與受精率、胚胎質(zhì)量和妊娠有一定的相關(guān)性，則其可能作為一項預測IVF結(jié)局的危險因素，將CatSper2作為改善IVF不佳結(jié)局的一個可能性的靶點。通過進一步研究CatSper2導致精子活力降低的原因，可能通過提高CatSper2在精子中的表達從而改善IVF的不佳結(jié)局。遺憾的是，本實驗結(jié)果表明CatSper2只與活力有相關(guān)性，與受精率、胚胎質(zhì)量和妊娠并無相關(guān)性(P>0.05)。一項回顧性的研究表明，與正常精子比較，活力差的精子授精后其輔助生殖助孕的結(jié)局不佳[117]。Correia等[18]的研究結(jié)果表明，CatSper2在精子超活化等方面發(fā)揮重要的作用，但不是一個發(fā)育性標志。Quill等[19]研究表明CatSper敲除的精子尾部無“鞭打”運動，基本無前向運動。由此可知，CatSper的作用在于使精子穿透卵母細胞外殼，而對卵母細胞激活和精卵融合無意義。Bhilawadikar等[17]的研究結(jié)果與本研究一致，結(jié)論為CatSper2與精子活力相關(guān)，而與受精率、胚胎質(zhì)量的相關(guān)性不明顯。

綜上所述，CatSper2與精子活力相關(guān)，而與精子濃度、受精率、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的相關(guān)性并不明顯，提示其對助孕治療妊娠結(jié)局的預測意義不大。但是由于受到研究數(shù)量的限制，研究結(jié)果可能存在一定偏差。后續(xù)需要進一步擴大研究對象，做更深層次的研究，為輔助生殖的不良結(jié)局尋找新的解決方案和治療途徑。