仝雪 曹珂珂 趙祝福

摘 要：為了篩選高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌，從酸奶、奶酪中通過富集和分離得到7株乳酸菌，以菌落拉絲實(shí)驗(yàn)為初篩指標(biāo)和苯酚-硫酸法測(cè)胞外多糖產(chǎn)量的復(fù)篩方法得到1株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的優(yōu)良菌株YL2。并且對(duì)YL2菌株進(jìn)行培養(yǎng)特征、個(gè)體形態(tài)特征和生理生化鑒定試驗(yàn)，初步確定YL2為乳桿菌屬（Lactobacillus），其胞外多糖的產(chǎn)量為430.0mg/L。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；胞外多糖；選育；鑒定

中圖分類號(hào) Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）13-0013-03

Abstract：In order to screen high-producing extracellular polysaccharide lactic acid，bacteria，seven strains of lactic acid bacteria were obtained from yoghurt and cheese by enrichment and separation.The screening test was performed using the colony wire drawing test and the screening method for extracellular polysaccharide production by the phenol-sulfuric acid method.One high-yield extracellular polysaccharide lactic acid bacteria was obtained which the strain was YL2.The culturing characteristics，morphological characteristics，physiological and biochemical identification tests of YL2 strain were carried out，and YL2 was preliminarily identified as Lactobacillus.The extracellular polysaccharide yield was 430.0 mg/L.

Key words：Lactic acid bacteria；Exopolysaccharides；Breeding；Identification

微生物胞外多糖是在微生物生長和代謝的過程中產(chǎn)生并且分泌到細(xì)胞外，常常滲透于周圍空間和培養(yǎng)基中的一類多糖化合物。在自然環(huán)境中，微生物胞外多糖的存在起著保護(hù)菌株的作用[1-2]。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長過程中分泌出的一種特殊水溶性多糖物質(zhì)[3]，是一種天然的高分子聚合物。從奶及奶制品中選育出的乳酸菌，可增稠奶制品，賦予奶制品良好的穩(wěn)定性、風(fēng)味和口感，使奶制品看起來細(xì)膩潤滑、口味獨(dú)特等[4]，并且它還具有良好的生理功效。目前，酸乳發(fā)酵的菌株產(chǎn)多糖的量較低，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)所需[5]，因此，選育高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌并優(yōu)化產(chǎn)胞外多糖的工藝條件等仍是當(dāng)下的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 酸奶、奶酪、泡菜、MRS肉湯培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基等。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 顯微鏡、微生物培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、低溫冰箱、超純水系統(tǒng)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的富集與分離 分別選取10mL的酸奶、奶酪和泡菜，接種于裝有100mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48～72h。取富集后的培養(yǎng)液1mL加入9mL無菌水，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6，分別吸取-5、-6這2個(gè)稀釋度的菌懸液0.05mL涂布于加有1%CaCO3的MRS平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，37℃恒溫培養(yǎng)24h左右。觀察并記錄菌落特征，選擇有明顯溶鈣圈的菌落進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 乳酸菌的純化和初步鑒定 為了獲得純培養(yǎng)物，選擇溶鈣圈明顯的菌落在MRS平板上反復(fù)的劃線直至得到單菌落。對(duì)純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)以及過氧化氫酶試驗(yàn)，在試驗(yàn)結(jié)果中顯紫色，G+，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)為陰性的菌株可以初步判斷為乳酸菌。4℃的冰箱中保藏。

1.2.3 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的初篩 由于培養(yǎng)的乳酸菌的菌落粘度、外力拉絲度和它本身生產(chǎn)出的多糖產(chǎn)量呈正線性關(guān)系[5-6]，因此用菌落外力作用下的粘度大小可以作為乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量高低的根據(jù)，將分離純化的乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上劃線分離，37℃培養(yǎng)48h后，用無菌牙簽向上拉伸，通過測(cè)量，選擇菌落粘度大、拉絲長度較大的進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的復(fù)篩 （1）胞外多糖的提?。簠⒖紡堄颀圼7]的方法，20mL、37℃培養(yǎng)24h的菌懸液，6000r/min離心20min，在離心后的上清液中加入10mL的TCA溶液，4℃靜置12h，后6000r/min離心20min，取上清液加入透析袋中，4℃透析24h，再加入3倍體積的95%vol乙醇，4℃靜置過夜，再次6000r/min離心15min，除去上清液，即得沉淀后的胞外多糖，備用。（2）胞外多糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法，參照張惟杰[8]的做法，以葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定菌株的胞外多糖產(chǎn)生量。

1.2.5 產(chǎn)胞外多糖菌株的鑒定[9] 個(gè)體形態(tài)和菌落形態(tài)的培養(yǎng)與觀察；生理生化鑒定：對(duì)產(chǎn)胞外多糖乳酸菌進(jìn)行H2O2的測(cè)定實(shí)驗(yàn)、牛奶反應(yīng)、V-P試驗(yàn)、H2S的產(chǎn)生試驗(yàn)和菌株生長條件的實(shí)驗(yàn)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化 從酸奶、奶酪和泡菜中富集分離得到多種菌株，將有明顯溶鈣圈而且乳酸菌的菌落特征特典型的菌落選出來，再對(duì)這些菌落反復(fù)劃線進(jìn)行純化，觀察這些菌落的形態(tài)特征。其中G+、過氧化氫酶陰性，而且沒有芽孢的菌株初步判定為乳酸菌，挑選7株菌株保存。

2.2 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的初篩 對(duì)7株乳桿菌進(jìn)行初篩拉絲實(shí)驗(yàn)，選出相對(duì)較優(yōu)的3株分別為MN1、YL2和PC2，如圖1所示。

2.3 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的復(fù)篩 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.0025x+0.0206，R2=0.9947。通過苯酚-硫酸法測(cè)得MN1、YL2和PC2乳酸菌的胞外多糖產(chǎn)量分別為272.42mg/L、430.00mg/L、357.83mg/L，其中編號(hào)為YL2的菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中的EPS產(chǎn)量最高，選定為目的菌株。

2.4 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的鑒定 （1）菌落觀察菌株YL2在MRS培養(yǎng)基上的菌落為圓形，乳白色，邊緣整齊，濕潤、有光澤，不透明，較粘稠，易挑起。（2）細(xì)胞形態(tài)觀察 在顯微鏡下觀察該菌株，為長桿狀或短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性，紫色。（3）生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由表1可知，運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖酸鹽產(chǎn)氣、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，說明YL2乳酸菌不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)氣、明膠不液化和無H2S氣體產(chǎn)生；淀粉水解、牛奶試驗(yàn)等為陽性；由表2可知，該菌株可以利用葡萄糖和乳糖等，不利用半乳糖、麥芽糖等；由表3可知，YL2乳酸菌在耐鹽實(shí)驗(yàn)中，NaCl濃度為2%、5%的固體培養(yǎng)基上均有生長，濃度越大菌落數(shù)越少，7%濃度下不生長；YL2乳酸菌在耐酸堿實(shí)驗(yàn)中，在pH4.5和6.0條件下生長，在pH7.5時(shí)不生長；YL2乳酸菌在溫度梯度實(shí)驗(yàn)中，在35℃培養(yǎng)下的菌長勢(shì)最好，10℃時(shí)生長緩慢。

根據(jù)上述形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和菌種生長條件實(shí)驗(yàn)并對(duì)照《乳酸細(xì)菌分離鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[10]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]初步鑒定出YL2菌株為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

3 結(jié)論

通過富集、劃線分離從酸奶中分離純化出7株乳酸菌，采用初篩的菌落拉絲法測(cè)其粘度和復(fù)篩測(cè)其胞外多糖的產(chǎn)量，從7株乳酸菌中篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖菌株YL2，其EPS產(chǎn)量為430.0mg/L。根據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和生理生化特征初步鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

參考文獻(xiàn)

[1]霍思序，唐彥君，劉寧.乳酸菌胞外多糖生理功能的研究進(jìn)展[J].食品科技，2013，2（9）：153-157.

[2]李超，王春鳳，楊桂連.乳酸菌胞外多糖腸道黏附及免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2014，35（11）：314-318.

[3]Ramchandran L，Shah N.Effect of exopolysaccharides on the proteolytic and angiotensin-I converting enzyme-inhibitory activities and textural and rheological properties of low-fat yogurt during refrigerated storage[J].Journal of Dairy Science，2009，92（3）：895-906.

[4]馬靜.乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖及其在乳品中的應(yīng)用研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[5]劉芳，黃丹，陳永貴，等.一株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定[J].中國乳品工業(yè)，2013，41（12）：17-18.

[6]田豐偉，丁虎生，丁娜，等.產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌的簡便篩選與鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：15-19.

[7]張玉龍，胡平，王金龍，等.產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及抗氧化特性研究[J].中國釀造，2015，34（10）：37-38.

[8]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：11-12.

[9]劉燕.高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[10]凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：85-86，117-124.

[11]BUCHNAN R，GIBBONS E.伯杰氏鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1984. （責(zé)編：張宏民）