盧曉藝 華麗萍 李煌 徐偉 褚克丹 葉向麗

【摘 要】 目的：建立同時(shí)測(cè)定鼠曲草不同部位3種黃酮類(lèi)化合物（槲皮素、木犀草素、芹菜素）含量的高效液相色譜法。方法：采用Diamonsil-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸（50∶50），等度洗脫，流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。結(jié)果：槲皮素、木犀草素、芹菜素的進(jìn)樣量分別在0.122～2.434、0.147～2.940、0.094～1.880 μg范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系，r分別為0.999 4、0.999 7、0.999 6，方法的精密度、重復(fù)性均滿(mǎn)足分析要求，方法的回收率均大于98%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、快速、高效，可用于鼠曲草不同部位中3種黃酮類(lèi)化合物的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 鼠曲草；不同部位；槲皮素；木犀草素；芹菜素

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）03-0036-04

Abstract：Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of three flavonoids （quercetin， luteolin， apigenin） in different parts of Gnaphalium affine D.Don. Methods Diamonsil - C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） column was adopted. The mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid （50∶50） solution with the isocratic elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was 360 nm. Results There was a good linear relationship between content and peak area when the quercetin， luteolin and apigenin were within the range of 0.122 ～ 2.434（r= 0.9994）， 0.147 ～ 2.940（r= 0.9997）， 0.094 ～ 1.880μg（r= 0.9996）.The performance characteristics of precision and reproducibility of the developed HPLC method fulfilled the analysis requirements.Conclution The method is simple， rapid and efficient， and applicable for determination of three flavonoids in different parts of Gnaphalium affine.

Keywords：Gnaphalium Affine； Different Parts； Quercetin； Luteolin；Apigenin

鼠曲草又名佛耳草、清明菜、白艾，系菊科鼠曲草屬植物Gnaphalium affine D.Don，全草入藥，收載于1977年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中[1]。多生于路旁、田邊、山坡草地等處，我國(guó)黃河流域以南各省區(qū)均有分布，也見(jiàn)于墨西哥、阿根廷、危地馬拉、玻利維亞等中南美洲國(guó)家。據(jù)報(bào)道，鼠曲草全草中含有5%黃酮苷[2]，是鼠曲草主要的活性成分。黃酮類(lèi)化合物藥理活性豐富，具有抗菌抗氧化[3-7]、改善糖尿病血脂紊亂[8]、止咳祛痰[9]、保肝[10]、鎮(zhèn)痛[11]、抗炎[12-14]，改善氣道炎癥[15]和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥狀[16]的作用，對(duì)高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[17]也有一定的治療作用等，在南非國(guó)家用鼠曲草來(lái)治療呼吸道和腸胃道疾病[18]。

本研究擬采用高效液相色譜技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定鼠曲草中槲皮素、木犀草素和芹菜素的檢測(cè)方法，并將該方法應(yīng)用于鼠曲草不同部位中3種黃酮類(lèi)化合物的分析檢測(cè)，為鼠曲草總黃酮和黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料 鼠曲草購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)承創(chuàng)堂，蘆?。ā?8%，Rutinhydrate，批號(hào)：100080-201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、槲皮素（≥98%，Quercetin，批號(hào)：C20J6Y1722，上海源葉生物科技有限公司）、木犀草素（≥98%，Luteolin，批號(hào)：C10016987，上海麥克林生化科技有限公司）、芹菜素（≥98%，Apigenin，批號(hào)：K27A6C1，上海源葉生物科技有限公司）。甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）、磷酸（分析純，批號(hào)：20160521，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）、乙醇（分析純，批號(hào)：20170311，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氫氧化鈉（分析純，批號(hào)：1404102，西隴化工股份有限公司）、亞硝酸鈉（分析純，批號(hào)：1608011，上海聯(lián)試化工試劑有限公司）、硝酸鋁（分析純，廠(chǎng)家：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)：20160426）、Na2CO3（分析純，批號(hào)：20130613，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

1.2 儀器 Ultimate-3000型高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）、UV-1800紫外分光光度計(jì)（日本島津）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、XS105型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Diamonsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按槲皮素、木犀草素、芹菜素峰計(jì)，應(yīng)分別不低于5000、6000、7000。色譜圖如圖1所示。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 將槲皮素、木犀草素、芹菜素分別溶解于甲醇中，使其濃度約為10 μg/mL，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到吸收曲線(xiàn)如圖2所示，因?yàn)榭紤]到同時(shí)檢測(cè)，所以選擇360 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取槲皮素6.08 mg于10 mL容量瓶、木犀草素1.47 mg于2 mL容量瓶、芹菜素2.35 mg于5 mL容量瓶，加甲醇溶解，定容置刻度線(xiàn)，得到濃度為0.608 mg/mL槲皮素、0.735 mg/mL木犀草素、0.470 mg/mL芹菜素儲(chǔ)備液，再分別精密吸取1 mL上述儲(chǔ)備液于5 mL容量瓶，加甲醇定容置刻度線(xiàn)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液作為混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備[19] 分別稱(chēng)取5 g花、莖、葉、鼠曲草，按照料液比1∶35加入65%乙醇，超聲波輔助提取兩次（超聲波功率350 W，提取溫度35 ℃），每次35 min，合并提取液，過(guò)濾，濃縮，定容至25 mL容量瓶，搖勻，靜置。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液，平行做三份供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定槲皮素、木犀草素、芹菜素，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到3種成分的回歸方程，相關(guān)系數(shù)與線(xiàn)性范圍。見(jiàn)表1。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為0.66%、0.64%、0.94%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于室溫放置 0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰面積的RSD值，結(jié)果槲皮素、木犀草素、芹菜素各組分峰面積的RSD值分別為2.43%、2.87%、2.09%，均小于 3.0%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一樣品5份，按照“2.4”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)得槲皮素、木犀草素、芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.59%、1.13%、1.89%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的鼠曲草樣品2.5 g 共6份，分別置250 mL具塞錐形瓶中，分別加入槲皮素、木犀草素和芹菜素的對(duì)照品溶液適量，按照“2.4”項(xiàng)下的方法處理樣品，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定各待測(cè)成分的量，計(jì)算回收率與RSD值?；厥章试囼?yàn)結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、芹菜素的平均回收率分別為99.18%、100.73%、98.70%，RSD值分別為： 1.92%、2.27%、2.56%。見(jiàn)表2。

2.6 樣品測(cè)定 按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件對(duì)鼠曲草不同部位和全草中的槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量進(jìn)行測(cè)定。色譜圖如圖3所示，其結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 色譜條件的確定 將槲皮素、木犀草素、芹菜素配制成混合對(duì)照品，進(jìn)行液相色譜分析，因3種黃酮均含有多個(gè)酚羥基，具有一定的酸性，為保證實(shí)驗(yàn)獲得較好的峰形，采用一定濃度的磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH值，改善分離效果。實(shí)驗(yàn)最終以0.2%磷酸溶液作為緩沖劑，可得到較好的色譜峰。實(shí)驗(yàn)以乙腈和磷酸作為流動(dòng)相，但由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，雜峰對(duì)上述3種化合物的峰有干擾且分離度沒(méi)有達(dá)到規(guī)定要求，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲醇-水體系較乙腈-水體系更有利于待測(cè)化合物的分離；所以選擇甲醇-0.2%磷酸溶液作為洗脫劑；實(shí)驗(yàn)表明等度洗脫更有利于物質(zhì)的分離，經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定“2.1”項(xiàng)下所示的色譜條件。該條件既可縮短樣品中槲皮素、木犀草素、芹菜素3種待測(cè)黃酮化合物的分析時(shí)間，又能達(dá)到較好的分離效果。

3.2 不同部位3種黃酮類(lèi)化合物的含量測(cè)定 從表2和圖3中數(shù)據(jù)可知，用HPLC法同時(shí)測(cè)定鼠曲草全草和花中3種黃酮類(lèi)化合物，花和鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量均不相同，花中3種黃酮類(lèi)成分的量均最高，同時(shí)其含量又是木犀草素>槲皮素>芹菜素，莖和葉中未檢測(cè)出這3種成分或量過(guò)低沒(méi)有達(dá)到檢測(cè)限，從而推測(cè)鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素這3種成分主要分布在花中。

我國(guó)鼠曲草資源豐富，分布廣泛，可藥食兩用。鼠曲草中富含黃酮類(lèi)成分，具有多種藥理活性，是一種極具開(kāi)發(fā)利用潛質(zhì)的生物資源。但是目前國(guó)內(nèi)對(duì)鼠曲草的研究較少，尤其是對(duì)鼠曲草的化學(xué)成分以及定量測(cè)定的研究相對(duì)較少，這是對(duì)鼠曲草利用價(jià)值的極大浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC法分析鼠曲草各部位中3種黃酮類(lèi)成分的分布情況，方法學(xué)考察表明，所建立的方法線(xiàn)性關(guān)系和重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于鼠曲草不同部位槲皮素、木犀草素、芹菜素的定量分析。

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（收稿日期：2017-12-13 編輯：程鵬飛）