白花蛇舌草HPLC指紋圖譜的研究

楊 健，郭書臺,竇建衛(wèi)

(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院，西安 710003；2.西安綠葉藥物研究有限公司，西安 710054；3.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

白花蛇舌草為茜草科植物HedyotisdiffusaWilld.的干燥全草，收載于廣西中藥志[1]和江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(1989年版)[2]，具有清熱解毒、利濕消癰的作用，臨床主要用于腸癰、疔癤腫毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、濕熱黃疸和小便不利等[1]；現(xiàn)代藥理研究表明，本品有抗菌、增強(qiáng)免疫[3-4]、抗衰老和抗腫瘤[5-7]作用。白花蛇舌草主要產(chǎn)于福建、廣東、香港、廣西、海南、安徽和云南等地。白花蛇舌草中含三十一烷、豆甾醇、烏索酸、土當(dāng)歸酸[8-9]、β-谷甾醇、胡蘿卜苷、熊果酸、2-羥基-3-甲基-1-甲氧基蒽醌、2-羥基-7-甲基-3-甲氧基蒽醌、E-6-O-對甲氧基肉桂?；u屎藤苷甲酯、E-6-O-香豆酰基雞屎藤苷甲酯[10]、香豆酸、對香豆酸甲酯、2-醛基-5-羥甲基呋喃、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、胡蘿卜苷[11]、車葉草苷、去乙酰車葉草苷、京尼平苷、10-去氫京尼平苷、交讓木苷、diffusoside A、diffusoside B、松柏苷、雞屎藤次苷甲酯、乙酰雞屎藤次苷甲酯、去乙酰車葉草酸苷甲酯、羥異梔子苷、水晶蘭苷甲酯、galioside 10-acetate、地芰普內(nèi)酯[12]、雞屎藤次苷甲酯、10-去氫京尼平苷和2-羥基-3-甲基蒽醌等成分[13]，此外還含有少量揮發(fā)性成分[14]。

中藥指紋圖譜是一種綜合、可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，整體性和模糊性為其顯著特點(diǎn)[15-18]。由于白花蛇舌草成分較為復(fù)雜，很難將其中的單一成分或某一類成分作為測定指標(biāo)來進(jìn)行質(zhì)量控制，因此考慮將指紋圖譜納入到藥材的質(zhì)量控制體系中，以便考察藥材和制劑的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)用福建產(chǎn)的白花蛇舌草藥材作為原料基源，采用HPLC法對不同時(shí)間采收的藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究，建立了藥材的指紋圖譜控制方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀，DIONEX P680 HPLC Pump，UVD170U檢測器，DIONEX Chromeleon 6.80色譜工作站(美國Dionex公司)；色譜柱(Phenomenex C18，150 mm×4.6 mm，5 μm)，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司；BS110S型分析天平，德國賽多利斯公司；AU250D型0.01 mg分析天平，日本島津儀器有限公司；TDA-8002型恒溫水浴鍋，北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司。

1.2試藥 槲皮素對照品(批號10081-200907)，熊果酸(批號110742-201202)，供含量測定用，由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，Merck公司生產(chǎn)；水為超純水；其余試劑均為分析純。

福建省為白花蛇舌草的主產(chǎn)地之一，本實(shí)驗(yàn)所用藥材均為福建福清地區(qū)不同采收期的藥材樣品，見表1。

表110批白花蛇舌草藥材來源

Tab.1 The sources of 10 batches ofHedyotisdiffusaWilld.

樣品編號產(chǎn)地批號采收時(shí)間1福建201407012014年7月2福建201408022014年8月3福建201409012014年9月4福建201507032015年7月5福建201508012015年8月6福建201509012015年9月7福建201509022015年9月8福建201607012016年7月9福建201608012016年8月10福建201608022016年8月

2 方法

2.1色譜條件 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，以C18柱作為分離色譜柱，流速為1.0 mL·min-1，分別在波長203，254，270和360 nm處檢測，梯度洗脫程序見表2。

表2梯度洗脫程序

Tab.2 The gradient elution programs

時(shí)間/minA,乙腈/%B,2 mL·L-1磷酸水溶液/%05955892402278603565755545806040856040

結(jié)果表明，在梯度洗脫的情況下，以乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液為流動(dòng)相對樣品中各成分的分離效果較好，在203 nm波長處，檢出的峰更多，且有多個(gè)峰的響應(yīng)值較高，具有明顯的特征性，故檢測波長確定為203 nm。

2.2供試品溶液的制備 取藥材，粉碎，過60目篩，取粉末2 g，置于具塞燒瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇20 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓浦?5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3分析時(shí)間 在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，考察2 h，結(jié)果表明，在85 min內(nèi)，樣品中所有峰均可完全被洗脫，故分析時(shí)間確定為85 min。

2.4參照峰的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白花蛇舌草藥材中含有槲皮素、熊果酸、豆甾醇和β-谷甾醇-D-葡萄糖苷等，還含有環(huán)烯醚萜苷類成分和車葉草苷等化學(xué)成分[8-14]。選用槲皮素作為對照品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果槲皮素色譜峰很低，說明其在藥材中的含量較少；又考察了熊果酸，結(jié)果在本色譜條件下均為較小的色譜峰，有些批次甚至沒有檢出，因此無法采用。經(jīng)綜合考察對比，供試品色譜圖中峰面積最大的色譜峰與其他色譜峰能分離完全，沒有干擾，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)判斷比較穩(wěn)定，且在藥材、中間體及成品中均能穩(wěn)定存在，因此將其作為參照峰，計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)。

2.5指紋圖譜及其技術(shù)參數(shù) 取上述各批白花蛇舌草藥材樣品，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下分別吸取10 μL進(jìn)樣測定，HPLC圖見圖1。對各批白花蛇舌草藥材供試品指紋圖譜進(jìn)行分析，見圖2，確定其共有峰作為藥材的特征指紋色譜峰。

圖1白花蛇舌草藥材HPLC圖

Fig.1 Typical HPLC chromatogram ofHedyotisdiffusaWilld.

結(jié)果顯示，10批白花蛇舌草藥材指紋圖譜均分離出20多個(gè)色譜峰，將其結(jié)果導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，比較并采用中藥指紋圖譜相似度軟件計(jì)算，從中選定了16個(gè)共有峰作為藥材指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰，共有峰占總峰面積的90%以上，見圖3和表3。

以7號共有峰作為參照峰，計(jì)算相對保留時(shí)間、峰面積比值、平均相對保留時(shí)間和平均峰面積比值，結(jié)果見表4。計(jì)算公式如下：

相對保留時(shí)間(tr)=色譜峰保留時(shí)間÷參照峰的保留時(shí)間

峰面積比值(Ax/As)=色譜峰峰面積(Ax)÷參照峰的峰面積(As)

圖2白花蛇舌草不同批次藥材HPLC圖譜比較

Fig.2 HPLC chromatograms，comparison of theHedyotisdiffusaWilld. samples

圖3白花蛇舌草藥材指紋圖譜

1～16.特征指紋峰。

Fig.3 Fingerprints ofHedyotisdiffusaWilld.

1-16.characteristic fingerprint peak.

白花蛇舌草藥材指紋圖譜共有特征峰其主要參數(shù)如下。

相對保留時(shí)間(共有峰號)：0.213±0.002⑴，0.390±0.002⑵，0.410±0.003⑶，0.640±0.002⑷，0.651±0.002⑸，0.720±0.002⑹，0.737±0.002⑺，0.877±0.005⑻，0.893±0.001⑼，0.928±0.005⑽，0.935±0.001⑾，1(S)⑿，1.035±0.008⒀，1.055±0.001⒁，1.089±0.001⒂，1.117±0.001⒃。

峰面積比值(共有峰號)：0.033±0.008 ⑴，0.101±0.025⑵，0.034±0.003⑶，0.027±0.004⑷，0.290±0.026⑸，0.105±0.009⑹，0.078±0.006⑺，0.196±0.044⑻，0.050±0.026⑼，0.115±0.014⑽，0.111±0.014⑾，1(S)⑿，0.240±0.050⒀，0.310±0.038⒁，0.072±0.111⒂，0.033±0.005⒃。

將10批白花蛇舌草藥材指紋圖譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度軟件(中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版)，經(jīng)中藥指紋圖譜相似度軟件計(jì)算，得出白花蛇舌草藥材指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，各批樣品均與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果10批樣品的相似度分別為0.995，0.998，0.996，0.998，0.996，0.989，0.998，0.989，0.996和0.997，相似度均大于0.95。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察指紋圖譜相似度變化情況，結(jié)果顯示，相似度分別為0.996，0.990，0.994，0.992和0.991。結(jié)果表明，連續(xù)5次進(jìn)樣相似度無明顯變化，RSD值為0.24%，表明儀器的精密度良好。

2.6.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12和24 h取樣檢測，考察指紋圖譜相似度變化情況，測得相似度結(jié)果分別為0.995，0.990，0.992，0.989和0.994。結(jié)果表明，在24 h內(nèi)，樣品在各檢測時(shí)間點(diǎn)的相似度無明顯變化，RSD值為0.26%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號藥材(20140802)共5份，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下檢測，考察重復(fù)性，結(jié)果5份樣品的相似度分別為0.992，0.986，0.997，0.989和0.995。結(jié)果顯示，同批藥材的5份樣品制備的供試品溶液進(jìn)樣后測定的相似度無明顯差異，表明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

HPLC法是目前藥品質(zhì)量控制過程中較常用的方法，該方法簡便快捷、準(zhǔn)確度高，在指紋圖譜研究過程中常用[19-21]。

同一產(chǎn)地的白花蛇舌草不同采收期的藥材有一定差異，經(jīng)10個(gè)批次產(chǎn)品的測定結(jié)果比較后，從中選定了16個(gè)共有峰作為藥材指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰，共有峰占總峰面積的90%以上，不同采收期的藥材與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對照，相似度結(jié)果均在0.9以上。

所建立的該地區(qū)白花舌蛇草藥材的指紋圖譜具有較高的專屬性，可作為藥材的鑒別方法，以該地產(chǎn)的白花蛇舌草作為藥材基源可確保不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。