一測多評法測定銀屑配方顆粒中4種生物堿的含量

張 偉，馬桂芝，王春芳，滕 亮

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830011)

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，與遺傳、免疫功能紊亂、感染和環(huán)境等多種因素有關(guān)[1-2]。某醫(yī)院用于治療銀屑病的銀屑配方顆粒由山豆根、白鮮皮、土茯苓、拳參、苦參、丹參、火麻仁、玄參和地黃組成，在臨床應(yīng)用中有患者出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)。文獻(xiàn)調(diào)研表明，方中苦參和山豆根中的化學(xué)成分以生物堿為主，這類喹諾里西啶類生物堿成分既是活性藥效成分，也是引發(fā)毒性反應(yīng)的成分[3]。苦參堿類生物堿可引發(fā)胃腸道不良反應(yīng)，嚴(yán)重者可致肌肉痙攣或全身抽搐，甚至導(dǎo)致呼吸停止而死亡[4]，還可引起神經(jīng)毒性和肝毒性等不良反應(yīng)[5-8]。為了探討銀屑配方顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)并對其生物堿含量進(jìn)行質(zhì)量控制，有必要對該方中苦參類生物堿進(jìn)行含量測定。因此，本文建立了一種同時(shí)測定銀屑配方顆粒中4種生物堿含量的HPLC法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 New Classic MF分析天平(瑞士梅特勒-托利多精密儀器有限公司)；KQ500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LC-20AD 高效液相色譜儀，SPD-M20A 230 V 光電二極管陣列紫外可見光檢測器，Wondersil C18色譜柱(日本島津公司)；Milli-Q 艾柯超純水儀 (美國密理博公司)。

1.2試藥 山豆根配方顆粒(批號20170113)、白鮮皮配方顆粒(批號20161216)、土茯苓配方顆粒(批號20161117)、拳參配方顆粒(批號20151228)、苦參配方顆粒(批號20160909)、丹參配方顆粒(批號20161208)、火麻仁配方顆粒(批號20161218)、玄參配方顆粒(批號20161209)和地黃配方顆粒(批號20161103)，均購自廣東一方制藥有限公司；苦參堿對照品(批號X05J6M6)、氧化苦參堿對照品(批號Y30S6Y17043)和槐果堿對照品(批號Y06M8Y17029)，均購自上海源葉生物科技有限公司；氧化槐果堿對照品(批號JZ20140508)，購自南京景竹生物科技有限公司，對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不小于98%；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Wondersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-25 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值為3.0)(7∶93)[9]；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為25 ℃；檢測波長為220 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 精密稱取苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿對照品適量，加甲醇制成含苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別為370.0，137.6，75.8 和112.8 μg·mL-1的混合對照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.2.2供試品溶液 按照處方比例，精密稱定銀屑配方顆粒1 g，置于25 mL量瓶中，加入5 mL氯仿和1 mL氨水，超聲17 min，取出，放冷，用氯仿稀釋至刻度，搖勻，吸取上清液4 mL，用甲醇稀釋至10 mL[10]。用0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.2.3陰性樣品溶液 取不含苦參和山豆根的其余銀屑配方顆粒，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)選供試品超聲前處理?xiàng)l件 課題組前期采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比對4種生物堿的峰面積和的影響，發(fā)現(xiàn)超聲功率和超聲溫度對優(yōu)選指標(biāo)影響較小，可設(shè)定為固定因素，其水平分別固定為100 W、40 ℃，而超聲時(shí)間及料液比對優(yōu)選指標(biāo)影響較大。因此，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)選供試品超聲前處理?xiàng)l件，將超聲時(shí)間及料液比按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)的要求進(jìn)行因素水平的編碼，因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。料液比(A)和超聲時(shí)間(B)對峰面積和的響應(yīng)面三維圖見圖1。

表1實(shí)驗(yàn)的因素水平

Tab.1 Factors and levels of expert

因素水平-1.414-10+1+1.414料液比1∶41∶5.21∶81∶10.81∶12超聲時(shí)間/min1017.33552.760

圖1料液比、超聲時(shí)間對峰面積和的效應(yīng)面三維圖

Fig.1 Three-dimensional graph of the ratio of solid to liquid and ultrasonic time to sum of peak area

應(yīng)用Design Expert V8.0.6.1軟件對表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多元二次回歸擬合，得到回歸方程：y=332 800-24 948.35A-5 035.91B+12 412.50AB+13 284.06A2+3 681.69B2，方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，此模型極顯著(P<0.000 1)，模型的r=0.999 18，調(diào)整r=0.985 9，說明此模型可以解釋98.37%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，可認(rèn)為無失擬因素存在，回歸模型顯著，能夠較好地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用Design Expert V8.0.6.1軟件對優(yōu)選的含量測定條件進(jìn)行預(yù)測，A=5.2，B=17.3，峰面積和的預(yù)測值為365 557。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)可操作性將優(yōu)選的含量測定條件設(shè)定為：料液比為1∶5，超聲時(shí)間為17 min。根據(jù)此優(yōu)選條件制備供試品，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，所得峰面積和為361 476±476，RSD值為0.19%，結(jié)果表明，該前處理方法可較好地提取樣品中的目標(biāo)成分。

表2星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of central composite design

編號料液比超聲時(shí)間苦參堿槐果堿氧化槐果堿氧化苦參堿峰面積和1-1+1136 37949 99472 78668 622327 7812-1.4140158 18569 87159 54857 659345 2633-1-1150 70563 52279 14169 089362 457400116 17853 52984 96373 315327 9855+1+1113 81849 97486 33657 524306 55260-1.414135 82657 22885 05470 365348 473700120 44450 76881 02376 364328 599800126 52650 65388 50573 127338 8119+1.414083 31039 58884 97161 395269 26410+1-1111 48440 16883 12956 797291 5781100125 21452 73183 74572 173333 863120+1.414133 16455 82278 21766 714333 9171300117 80554 15585 09277 505334 557

表3擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

Tab.3 Variance analysis results of fitting regression equation

項(xiàng)目離均差平方和離散系數(shù)均方FP模型7.234×10951.447×10984.43<0.000 1A4.979×10914.979×109290.61<0.000 1B2.029×10812.029×10811.840.010 8AB6.163×10816.163×10835.970.000 5A21.228×10911.228×10971.64<0.000 1B29.429×10719.429×1075.500.051 4殘差1.199×10871.713×107失擬項(xiàng)3.877×10731.292×1070.640.629 7誤差8.117×10742.029×107總離差7.354×10912模型的確定系數(shù)0.983 7模型的調(diào)整確定系數(shù)0.972 0

2.4外標(biāo)一點(diǎn)法(ESM)的方法學(xué)考察

2.4.1專屬性實(shí)驗(yàn) 將2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液分別進(jìn)行HPLC分析，見圖2。結(jié)果表明，供試品溶液中的其他成分對4種生物堿的含量測定無影響，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)在2 000以上。

2.4.2線性關(guān)系考察 將2.2.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液進(jìn)行倍量稀釋，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積對對照品質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得到線性方程，見表4。

表44種成分的回歸方程和線性范圍

Tab.4 Regression equations and linear ranges of 4 constituents

成分回歸方程r質(zhì)量濃度范圍/μg·mL-1苦參堿y=7 422.3x+7 635.10.999 82.832 8～362.20槐果堿y=17 539x+1 522.80.999 91.053 5～134.85氧化槐果堿y=10 764x-4 722.80.999 80.580 3～74.28氧化苦參堿y=7 773.5x-5 470.40.999 80.863 6～110.54

圖2HPLC圖

A.混合對照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.苦參堿；2.槐果堿；3.氧化槐果堿；4.氧化苦參堿。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed standards；B.samples；C.negative samples；1.ma-trine；2.sophocarpine；3.oxysophocarpine；4.oxymatrine.

2.4.3精密度考察 制備1份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿4種化學(xué)成分的峰面積RSD值分別為0.80%，1.29%，0.58%和1.74%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性考察 制備1份供試品溶液，分別在0，4，6，12，16 和24 h測定。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿4種化學(xué)成分的峰面積RSD值分別為1.95%，1.93%，0.71%和1.63%。結(jié)果表明，該供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號銀屑配方顆粒，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測得苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿4種化學(xué)成分含量的RSD值分別為2.67%，3.88%，2.05%和1.79%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.4.6加樣回收率考察 按照銀屑配方顆粒處方比例，精密稱取銀屑配方顆粒6份，每份1 g，分別加入苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿對照品溶液適量。按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.7耐用性考察 對不同柱溫(20，25，30和40 ℃)，流速(0.6，0.8和1.0 mL·min-1)，檢測波長(215，220和225 nm)以及pH值(2.98，3.00和3.02)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，柱溫高于30 ℃時(shí)，槐果堿分離度小于1.5，表明柱溫對槐果堿的含量測定有影響，因此色譜柱柱溫應(yīng)控制在20～30 ℃之間。流速為0.6 mL·min-1時(shí)，色譜峰對稱性極差，流速為1 mL·min-1時(shí)，槐果堿分離度小于1.5，故選擇流速為0.8 mL·min-1。檢測波長為220 nm時(shí)，各峰的分離度更好，基線更穩(wěn)定，靈敏度更好，因此確定檢測波長為220 nm。在不同pH值磷酸鹽緩沖液條件下，各峰的分離度、對稱性無差別，提示在pH值為2.98～3.02磷酸鹽緩沖液條件下，均不影響4種生物堿的含量測定。見表5。

表5加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5 Results of recovery test

化學(xué)成分稱樣量/g樣品含量/μg加入量/μg測得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%苦參堿1.043 3963.9906.21 837.996.498.73.381.042 9963.5906.21 832.695.91.043 2963.8906.21 870.1100.01.043 2963.8906.21 895.7102.81.043 2963.8906.21 822.494.71.043 4964.0906.21 884.3101.5槐果堿1.043 3166.0153.7319.9100.2100.82.871.042 9165.9153.7316.097.71.043 2165.9 153.7323.3102.41.043 2165.9153.7321.4101.11.043 2165.9153.7314.796.81.043 4166.0153.7311.995.0氧化槐果堿1.043 3448.0430.0871.5898.599.92.281.042 9447.8430.0874.6499.31.043 2448.0430.0888.09102.41.043 2448.0430.0877.4199.91.043 2448.0430.0862.9796.51.043 4448.0430.0888.19102.4氧化苦參堿1.043 3573.8557.51 152.7103.8101.02.901.042 9573.6557.51 112.196.61.043 2573.8557.51 133.4100.41.043 2573.8557.51 152.2103.81.043 2573.8557.51 145.5102.51.043 4573.9557.51 124.598.8

2.5一測多評法(QAMS)的建立 將2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以苦參堿為內(nèi)參物，由相對校正因子計(jì)算公式fi/s=fi/fs=(Ai/Ci)/(As/Cs)(其中Ai和Ci分別為待測組分的峰面積和質(zhì)量濃度，As和Cs分別為內(nèi)參物的峰面積和質(zhì)量濃度)計(jì)算相對校正因子，同時(shí)計(jì)算相對保留值(RRT)和保留時(shí)間差(Δti/s)。計(jì)算公式為RRT=ti/ts，Δti/s=ti-ts(其中ti為待測組分保留時(shí)間，ts為內(nèi)參物的保留時(shí)間)[12-14]，見表6。

表6以苦參堿為參照的fi/s(多點(diǎn)校正法)

Tab.6fi/swith matrine as reference (multi-point correction method)

進(jìn)樣體積/μL其他成分相對于苦參堿的fi/s槐果堿氧化槐果堿氧化苦參堿其他成分相對于苦參堿的RRT槐果堿氧化槐果堿氧化苦參堿其他成分相對于苦參堿的Δti/s槐果堿氧化槐果堿氧化苦參堿22.1261.3510.9341.3581.9612.2036.7418.1022.6642.0581.3670.9291.3581.9632.2086.7018.0222.6052.1081.3670.9261.3591.9702.2136.6918.0722.6062.0981.3680.9361.3631.9732.2216.7518.0822.6982.0901.3690.9321.3581.9732.2206.6418.0522.64102.0431.3700.9321.3581.9632.2106.6617.9422.54平均值2.0871.3650.9311.3591.9672.2136.6918.0422.62RSD/%1.5100.5300.4100.1500.2600.3200.620.330.24

2.6一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較 按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定結(jié)果分別按照ESM和QAMS評價(jià)，驗(yàn)證QAMS是否適用于測定銀屑配方顆粒中4種生物堿的含量。結(jié)果表明，外標(biāo)一點(diǎn)法和一測多評法結(jié)果相對誤差較小(均小于2%)[15-16]，可用于銀屑配方顆粒中4種生物堿的含量測定。結(jié)果見表7。

表7外標(biāo)一點(diǎn)法和一測多評法的含量測定結(jié)果比較

Tab.7 Comparison of assay results between ESM and QAMS methods

編號苦參堿ESM槐果堿/μg·g-1ESMQAMSRE/%氧化槐果堿/μg·g-1ESMQAMSRE/%氧化苦參堿/μg·g-1ESMQAMSRE/%1931.97173.39171.481.10432.42425.141.68544.72548.540.702890.42162.47160.081.47421.87414.851.66539.62541.300.313947.82167.29164.831.48441.67434.521.62559.45565.161.024945.34163.78160.931.74418.93410.781.94543.40547.580.775931.50157.84154.612.04425.41417.801.79549.02553.180.766896.33170.45168.481.16436.01429.581.48564.61568.880.76平均含量/μg·g-1923.90173.39171.481.10429.39422.111.70550.14554.110.72

3 討論

3.1流動相種類的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-25 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(7∶93)、甲醇-2 mL·L-1三乙胺(45∶55)[17]、甲醇-0.5 mL·L-1三乙胺(70∶30)[18]、乙腈-磷酸鹽緩沖液(3∶97)[19]、乙腈-1 mL·L-1磷酸(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至8.0)(18∶82)[20]等不同流動相，結(jié)果表明，在甲醇-25 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液比例為7∶93的流動相條件下，4種生物堿分離度更佳。

3.2流動相比例的選擇 分別考察甲醇-25 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液比例為7∶93和10∶90的色譜行為，結(jié)果表明，甲醇-磷酸鹽緩沖液比例為7∶93時(shí)4種生物堿的分離度更好。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)45 min內(nèi)4種生物堿均被洗脫下來，但在該等度條件下125 min會出現(xiàn)拖尾嚴(yán)重的色譜峰，為避免對后續(xù)測定產(chǎn)生干擾并節(jié)約測定時(shí)間，43 min后用梯度洗脫法(43～48 min 93%～68%B，48～53 min 68%～45%B，53～58 min 45%B，58～68 min 45%～93%B，68～75 min 93%B)將該物質(zhì)洗脫出來，分析各樣品只需75 min。

3.3關(guān)于本測定方法精密度與準(zhǔn)確度的考慮 《中國藥典》2015年版四部所收載的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則(通則9101)提出，對于含量為0.01%的待測定成分，其重復(fù)性和加樣回收率的RSD值小于4%，對于含量為0.1%的待測成分，其重復(fù)性和加樣回收率的RSD值小于3%即可。本文樣品中4種生物堿含量均在0.01%～0.1%之間，因此，參照藥典相關(guān)規(guī)定，提示本法的重復(fù)性與準(zhǔn)確度在方法學(xué)考察可接受范圍內(nèi)。

3.4供試品前處理溶劑的選擇 稱取適量銀屑配方顆粒，置于錐形瓶中，用氯仿-氨水超聲提取，放冷，減壓回收至近干，用乙腈復(fù)溶。色譜結(jié)果顯示只有氧化苦參堿分離度較佳。

稱取適量銀屑配方顆粒，置于錐形瓶中，密閉瓶塞，分別用甲醇、甲醇-氨水超聲提取，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。結(jié)果顯示，二者提取的物質(zhì)成分復(fù)雜，干擾色譜峰極多，無法實(shí)現(xiàn)4種生物堿的有效分離。

3.5一測多評法的評價(jià) 苦參堿價(jià)廉易得，且在銀屑配方顆粒中含量最高，本研究以苦參堿為內(nèi)參，用測得的相對校正因子計(jì)算其余3種成分的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為后續(xù)測定銀屑配方顆粒中4種生物堿的含量提供了依據(jù)。利用相對保留值和保留時(shí)間差均可對4種生物堿定位。