虎眼萬年青愈傷組織培養(yǎng)的研究

趙栢翎 張瑋 夏辰旭 關(guān)鳳濤 楊國會

【摘 要】以虎眼萬年青子鱗莖為外植體，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加6-BA及NAA，對其愈傷組織的生長情況進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：適于愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，適宜的繼代培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，形成的愈傷組織質(zhì)地疏松，顏色淺黃而透明，形成易分散的顆粒。在25℃，130r/min，600Lx 12h的循環(huán)光照下在MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 的液體優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，18天后，篩選獲得最佳虎眼萬年青的懸浮細(xì)胞系。

【關(guān)鍵詞】虎眼萬年青;愈傷組織;懸浮細(xì)胞系

虎眼萬年青（Ornithogalum caudatum Ait）為百合科虎眼萬年青屬常綠多年生草本植物的干燥全草，又名胡連萬年青、海蔥、葫蘆蘭、珍珠草、鳥乳花，屬常見的觀賞花卉，原產(chǎn)于非洲南部，我國各地廣泛栽培[1]。虎眼萬年青有極高的藥用價(jià)值，虎眼萬年青球莖中含有大量的生物堿及化學(xué)成分，已測出的化學(xué)成分有27種之多，藥理學(xué)研究表明虎眼萬年青中的虎眼萬年青皂苷OSW -1對肺癌、乳腺癌有明顯的抗癌活體，體外抗p338淋巴細(xì)胞白血病活性結(jié)果表明，0SW - 1是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍，而且對正常細(xì)胞沒有毒性，因此，是一種極具開發(fā)潛力的中草藥[2]。服用本品可以增強(qiáng)人體免疫功能，抑制腫瘤，預(yù)防高血壓、糖尿病、動脈硬化等疾病[3]。有研究表明，虎眼萬年青不僅是一種觀賞花卉，而且也是一種具有開發(fā)前景的藥用植物[4]。本項(xiàng)目主要進(jìn)行虎眼萬年青細(xì)胞培養(yǎng)研究。經(jīng)查新，目前關(guān)于虎眼萬年青細(xì)胞培養(yǎng)的研究方面的文獻(xiàn)資料還未見報(bào)道。為此，筆者著重研究不同激素配比的培養(yǎng)基對虎眼萬年青組織培養(yǎng)的研究，確定出最佳方案，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)化工廠化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

虎眼萬年青子鱗莖，2018年1月采自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院九站校區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 取虎眼萬年青子鱗莖，剝?nèi)ケ砥げ⒂蔑柡拖匆路矍峙?h，然后用自來水反復(fù)沖洗干凈，移入超凈工作臺，用75%的酒精浸泡50s，再用0.1%HgCl2溶液處理15min，無菌水沖洗3-5次。

1.2.2 培養(yǎng)基 愈傷組織誘導(dǎo)的初代培養(yǎng)基共9種配比，分別記做：A1：MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.5mg/L;A2：MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.5mg/L ; A3：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 1.5mg/L;A4：MS+6-BA0.5mg/L+NAA 2.0mg/L;A5：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 2.0mg/L ;A6：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 2.0mg/L ;A7：MS+6-BA0.5mg/L+NAA 2.5mg/L;A8：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 2.5mg/L;A9：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 2.5mg/L;誘導(dǎo)愈傷組織的繼代培養(yǎng)基共4種配比，分別記做：B1：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L;B2：MS+6-BA0.5mg/L+NAA2.5mg/L;B3：MS+6-BA1.0mg/L+NAA2.5mg/L;B4：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L;建立細(xì)胞懸浮體系的液體培養(yǎng)基共3種配比，分別記做：C1：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA1.5mg/L;C2：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L;C3：MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA2.5mg/L。

1.2.3 接種和培養(yǎng) 將每個(gè)子鱗莖切成8塊接種到培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種2塊，每個(gè)處理接種10瓶，共90瓶，形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度（25±2℃），進(jìn)行暗培養(yǎng)。培養(yǎng)20d后，選擇誘導(dǎo)率高的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每瓶接種2塊，每個(gè)處理接種20瓶，共80瓶，培養(yǎng)溫度（25±2℃），進(jìn)行暗培養(yǎng)，20d接種到液體培養(yǎng)基上進(jìn)行搖床培養(yǎng)，接種量為10g/130mL，溫度25℃，轉(zhuǎn)數(shù)130r/min，600Lux，12h循環(huán)光照，裝液量130mL/250mL，培養(yǎng)18d，觀察愈傷組織生長狀況[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比濃度的培養(yǎng)基對虎眼萬年青愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

在相同條件下（基本培養(yǎng)基相同，培養(yǎng)條件相同），當(dāng)激素NAA為1.5 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度梯度的增加，愈傷組織的平均誘導(dǎo)率逐漸增加;當(dāng)激素NAA為2.0 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度梯度的增加，愈傷組織的平均誘導(dǎo)率增加不是很明顯，誘導(dǎo)率增幅較小;激素NAA為2.5 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度梯度的增加，愈傷組織的平均誘導(dǎo)率出現(xiàn)下降趨勢。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，由表1-2可知，A1與A4、A5、A6、A2、A9差異不顯著，A1與A7、A8差異顯著，A3與A7、A8差異顯著，A1與A3差異極顯著，即最佳培養(yǎng)基為A3：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L ，在A3中平均誘導(dǎo)率達(dá)到96.67%，效果最好，為繼代時(shí)形成質(zhì)地疏松的愈傷組織打下基礎(chǔ)。

2.2 不同激素配比濃度的培養(yǎng)基對虎眼萬年青愈傷組織生長的影響 。

在相同條件下（基本培養(yǎng)基相同，外界培養(yǎng)條件相同），當(dāng)激素NAA為2.5mg/L時(shí)，6-BA濃度由0.5mg/L增加至1.0mg/L，愈傷組織的平均誘直徑減少了1.49mm;當(dāng)激素6-BA的添加量是NAA添加量20倍時(shí)，顯然抑制了愈傷組織的生長;當(dāng)NAA的濃度與6-BA的濃度比為1：1時(shí)，最適合其生長。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，由表2可知，B1與B4、B3極顯著，B1與B2顯著，B2與B4顯著?？傻米钸m合愈傷組織生長的培養(yǎng)基是B1 ：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，在液體培養(yǎng)中有優(yōu)勢，增長效果明顯。

在愈傷組織繼代的第20天時(shí)，B1中有較大的球狀顆粒，因質(zhì)地松軟可在液體懸浮培養(yǎng)中有較大的明顯;B4中NAA濃度小于6-BA濃度，不適宜愈傷組織的生長而且較其他培養(yǎng)基相比生長緩慢，幾乎不形成顆粒，顏色偏綠。

2.3 不同激素配比濃度的液體培養(yǎng)基對虎眼萬年青愈傷組織懸浮體系形成的影響

愈傷組織在液體懸浮培養(yǎng)時(shí)起初生長極為緩慢，在第10天左右時(shí)，生長速度明顯增加，質(zhì)地疏松的愈傷組織在懸浮培養(yǎng)時(shí)易分散，充滿整個(gè)培養(yǎng)基，體積逐漸變大，質(zhì)地緊實(shí)的則在外圍直接長出小的、形狀不規(guī)則的愈傷組織，無分散現(xiàn)象。在液體培養(yǎng)的第18天時(shí)，經(jīng)觀察，愈傷組織在C2中的分散顆粒最多，長勢最好;C3次之;而在C1中長勢最差幾乎無改變。因此，最適合愈傷組織的液體培養(yǎng)基是C2：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 。初步形成無菌懸浮體系，為下一步研究提供了可靠的理論依據(jù)。

3 結(jié)論與討論

植物激素雖用量極小，但是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，而且在植物組織培養(yǎng)中起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用。用于植物組織培養(yǎng)的激素包括生長素、赤霉素和細(xì)胞分裂素等。生長素的主要

作用在于誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生及試管苗的生根，需要注意的是在使用時(shí)要配合其他激素;細(xì)胞分裂素有促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，延遲組織衰老，增加蛋白質(zhì)合成，抑制頂端優(yōu)勢，促進(jìn)側(cè)芽生長并且可以改變其他激素作用的特點(diǎn)。

脫分化是植物組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中成敗的關(guān)鍵，為建立無菌體系打下良好的基礎(chǔ)，試驗(yàn)研究過程中還發(fā)現(xiàn)外植體初代培養(yǎng)時(shí)間不宜過長，導(dǎo)致愈傷組織干癟，水分缺失，影響繼代。

在愈傷組織的培養(yǎng)過程當(dāng)中，出現(xiàn)污染的現(xiàn)象不可避免。本實(shí)驗(yàn)在繼代培養(yǎng)的第3天，有培養(yǎng)基出現(xiàn)污染情況，第一種污染現(xiàn)象是在試驗(yàn)材料附近出現(xiàn)粘液狀物體，培養(yǎng)基變渾濁（圖3）;第二種不同污染現(xiàn)象是在第五天時(shí)，培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色變化，部分呈現(xiàn)綠色，還有一部分為黑色塊狀，一直擴(kuò)散到培養(yǎng)基最底部。經(jīng)查閱文獻(xiàn) ，得知前者為細(xì)菌污染，主要的來源是由于接種材料和工具滅菌不徹底;后者為真菌污染，主要來源于環(huán)境。

通過試驗(yàn)初步確定虎眼萬年青形成愈傷組織初代培養(yǎng)最適培養(yǎng)基是MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，繼代培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，液體懸浮培養(yǎng)基為MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 。此結(jié)論為實(shí)現(xiàn)虎眼萬年青生產(chǎn)工廠化提供了一定的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張瑜，赫玉芳，南敏倫，等.虎眼萬年青研究進(jìn)展[J].中南藥

學(xué)，2010，8，（04）：293-295.

[2] 肖沖，魚紅閃.虎眼萬年青皂苷的分離提取[J].大連輕工業(yè)

學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，（02）：93-95.

[3] 丁景和.藥用植物學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1985.

[4] 楊國會，繆承陽，米春江.不同碳源對虎眼萬年青離體生長

的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37，（34）：16767-16768.

[5] 楊國會，米春江，繆承陽.不同激素水平對虎眼萬年青組織

培養(yǎng)的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50，（01）：183-184+188.