（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108）

隨著現(xiàn)代化設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步，蜜蜂等傳粉昆蟲為農(nóng)作物授粉增產(chǎn)的作用日益突出。然而，為防止各種農(nóng)作物的病蟲害，人們使用殺蟲劑等農(nóng)藥的種類和劑量正逐年遞增，不可避免地威脅著蜜蜂等有益昆蟲類群的生存安全。

新煙堿類殺蟲劑是世界范圍內(nèi)最有效、銷量最好的殺蟲劑，吡蟲啉則是此類殺蟲劑的典型代表，是第一個被合成的具有殺蟲活性的新煙堿類化合物[1]。吡蟲啉自引入市場以來發(fā)展迅速，在國內(nèi)被廣泛使用，有研究表明，它對蜜蜂的毒性屬于高毒級[2]，會破壞蜜蜂的記憶系統(tǒng)，使采集和學(xué)習(xí)能力下降[3,4]，影響蜜蜂的運動協(xié)調(diào)以及尋找和辨別食物的能力[5,6]，影響蜂群幼蟲的孵化率、化蛹率和羽化率[7,8]，對蜂王的生殖力和雄蜂的精子形成存在亞致死效應(yīng)[9]。

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）合稱昆蟲的保護(hù)酶系統(tǒng)[10]，這三者既有功能互補(bǔ)性又有定位互補(bǔ)性，共同構(gòu)成昆蟲有機(jī)體相互保護(hù)的防御系統(tǒng)[11]，其功能是清除機(jī)體內(nèi)過剩的活性氧，保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境脅迫的危害[12]。因此，當(dāng)蜜蜂處于受到殺蟲劑脅迫的逆境條件下，其體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)必然會對機(jī)體氧化應(yīng)激做出一定的反應(yīng)，以適應(yīng)不良環(huán)境。本實驗以實驗室條件下的蜜蜂工蜂為研究對象，通過考察低劑量吡蟲啉對蜜蜂生長發(fā)育及各發(fā)育時期保護(hù)酶系活性的影響，以期揭示蜜蜂保護(hù)酶系統(tǒng)在吡蟲啉脅迫下的變化規(guī)律，為進(jìn)一步探討蜜蜂對新煙堿類殺蟲劑的抗性機(jī)制提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

供試蜜蜂為實驗室人工飼育的本地意大利蜜蜂（Apis melliferaL.）。參考劉光楠和曾志將[13]蜜蜂幼蟲飼養(yǎng)配方，從1日齡幼蟲開始飼喂直至羽化出房，對照組（CK）飼喂基礎(chǔ)飼料，處理組1和處理組2進(jìn)行藥物的直接脅迫處理，分別在基礎(chǔ)飼料中添加LD10（0.01mg/ml）和LD50（0.1mg/ml）劑量殺蟲劑，每日觀察生長發(fā)育情況并記錄幼蟲成活率、化蛹率和羽化率。

1.2 試劑與儀器

總超氧化物氣化酶（T-SOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所；過氧化氫酶(CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；過氧化物酶(POD)試劑盒，南京建成生物工程研究所。Ultrospec 7000紫外可見分光光度計，英國柏楉有限公司；MGC-H人工氣候箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司。

1.3 樣品的制備

按照蜜蜂的不同發(fā)育時期采集各組樣品，分別是幼蟲期（5日齡蟲）、蛹期（5日齡蛹）和出房期（羽化出房時），收集樣品體內(nèi)的血淋巴液，-80℃保存，備用。

1.4 保護(hù)酶系活性測定

嚴(yán)格按照試劑盒的說明操作，計算得出各組樣品的SOD酶、CAT酶和POD酶的活力值。測定時每組樣品做3個平行處理，取平均數(shù)為酶活力值，所有待測樣本為同一批次樣本。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將獲得的實驗數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，采用數(shù)據(jù)分析中的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性測定，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低劑量吡蟲啉對蜜蜂生長發(fā)育的影響

吡蟲啉脅迫處理后，對蜜蜂幼蟲的成活率、化蛹率和羽化率的影響結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，隨著藥物脅迫處理劑量的升高，幼蟲成活率、化蛹率和羽化率呈下降趨勢。

圖1 吡蟲啉亞致死劑量對蜜蜂生長發(fā)育的影響

2.2 超氧化物歧化酶活性測定

低劑量吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時期SOD酶活性的影響見圖2，結(jié)果可知，對照組（CK）與處理組均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，飼喂吡蟲啉濃度越高，酶活力值越大，處理組2（LD50）中各發(fā)育期的酶活性明顯高于處理組1（LD10）和對照組（CK），其中蛹期SOD酶活性最高，其次是出房期和幼蟲期，且差異顯著（P＜0.05）。

圖2 吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時期SOD酶活性的影響

2.3 過氧化氫酶活性測定

低劑量吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時期CAT酶活性的影響見圖3，結(jié)果可知，對照組（CK）與處理組均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，對照組（CK）與處理組1（LD10）的變化曲線基本一致，處理組2（LD50）中各發(fā)育期的酶活性明顯高于處理組1（LD10）和對照組（CK），其中蛹期CAT活性最高，明顯高于幼蟲期和出房期，且差異顯著（P＜0.05）。

圖3 吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時期CAT酶活性的影響

2.4 過氧化物酶活性測定

低劑量吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時期POD酶活性的影響見圖4，結(jié)果可知，對照組（CK）與處理組均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，飼喂吡蟲啉濃度越高，酶活力值越大，處理組2（LD50）中各發(fā)育期的酶活性明顯高于處理組1（LD10）和對照組（CK），其中蛹期POD酶活性最高，其次是幼蟲期和出房期，且差異顯著（P＜0.05）。

圖4 吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時期POD酶活性的影響

3 討論

超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD是昆蟲體內(nèi)3種保護(hù)性酶系，三者協(xié)作調(diào)控增強(qiáng)機(jī)體的抗逆性，以應(yīng)對不良環(huán)境。對實驗中保護(hù)酶系的酶活性測定表明，處理組中的SOD酶活性、CAT酶活性和POD酶活性均高于對照組的酶活性，且酶活力值與中毒程度呈正相關(guān)，說明吡蟲啉的脅迫對蜜蜂體內(nèi)保護(hù)酶系的生成起到激活作用，即機(jī)體本身能夠提高其保護(hù)酶系活性，以適應(yīng)外源毒素的侵入，降解毒性，減少危害。

低劑量吡蟲啉對蜜蜂生長發(fā)育的直接影響是出現(xiàn)了延緩滯育現(xiàn)象，我們在飼喂蜜蜂時觀察到處理組的化蛹日期與羽化日期較對照組延后1～2日，最多5日，表明吡蟲啉脅迫對蜜蜂幼蟲的正常發(fā)育存在抑制作用。從蜜蜂體內(nèi)保護(hù)酶系活性在不同生長發(fā)育時期的變化上看，經(jīng)吡蟲啉處理后體內(nèi)3種保護(hù)酶的酶活力變化均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在蛹期時達(dá)到最大，幼蟲期和出房期的保護(hù)酶系酶活力因種類不同稍有差異。本實驗的研究結(jié)果說明，化蛹期是蜜蜂體內(nèi)保護(hù)酶系活性較高、解毒功能較強(qiáng)的階段，隨著日齡的增加，保護(hù)酶系活性逐漸降低。

目前國內(nèi)外關(guān)于新煙堿類殺蟲劑誘導(dǎo)的蜜蜂氧化損傷方面的研究重點集中在少數(shù)幾個蜜蜂種類及單一殺蟲劑，多在室內(nèi)暴露的效應(yīng)關(guān)系互作方面，且作用時間短，這與自然狀態(tài)下復(fù)雜的污染狀況不同。由于蜜蜂在現(xiàn)實生態(tài)環(huán)境中往往暴露于多種途徑的綜合污染[14]，因此怎樣有效的與野外實際相結(jié)合，研究不同殺蟲劑交互作用對保護(hù)酶系統(tǒng)協(xié)同作用的影響，科學(xué)的反應(yīng)保護(hù)酶系對蜜蜂的影響及抗性機(jī)理是今后應(yīng)深入開展的工作。