熒光分光光度法測(cè)定飼料中二氫吡啶的含量

◎ 戎筱卿

（蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

二氫吡啶是一種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑，現(xiàn)已取代瘦肉精成為國(guó)內(nèi)最常使用的飼料添加劑[1]。研究表明，二氫吡啶具有促進(jìn)豬、雞、牛、羊、魚的生長(zhǎng)，改善畜禽和魚產(chǎn)品品質(zhì)，提高豬、牛、羊、兔的繁殖性能及防病多種功能。所以，有必要對(duì)飼料中的二氫吡啶的含量加以控制。目前，測(cè)定飼料中二氫吡啶含量的方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法等[2]。但紫外分光光度法靈敏度低，特異性低，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確；高效液相色譜法操作繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)，不利于快速分析[3]。二氫吡啶天然具有熒光，但目前尚未利用熒光分光光度法測(cè)定二氫吡啶的含量[4]。所以，本實(shí)驗(yàn)擬采用熒光分光光度法建立飼料中二氫吡啶含量的測(cè)定方法，并運(yùn)用于質(zhì)量控制[5]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)，島津-GL通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平XS205，Mettler Toledo。

二氫吡啶對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)170322，純度為99.0%；氫氧化鈉、磷酸、甲酸，均為分析純；飼料從多個(gè)獸藥店采集，水為蒸餾水。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取二氫吡啶對(duì)照品15.20 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加1%磷酸乙腈適量超聲溶解，定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密移取儲(chǔ)備液1 mL置于100 mL棕色容量瓶中，加1%磷酸乙腈定容至刻度，即得濃度約為1 μg/mL的對(duì)照品使用溶液[6]。

1.2.2 供試品溶液

取飼料100 g研細(xì)，混合均勻，精確稱取10 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液60 mL，0 ℃水浴超聲20 min，取出，用1%磷酸乙腈溶液定容至刻度，搖勻。13 000 r/min離心5 min，移取上清液1 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取1.2.1中制得的對(duì)照品使用溶液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度依次為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL對(duì)照品溶液（L1-L5）。以1%磷酸乙腈溶液為空白溶劑，在Ex 363 nm、Em 448 nm下測(cè)定其吸光度[7]。以吸光度A為縱坐標(biāo)、濃度c為橫坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算回歸方程為A=545.9c+54.8，r=0.997 0。結(jié)果表明，二氫吡啶在0.05～1.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

準(zhǔn)確移取1.2.1中制得的二氫吡啶對(duì)照品使用溶液適量，以1%磷酸乙腈溶液為空白溶劑，將對(duì)照品溶液在激發(fā)波長(zhǎng)220～400 nm、發(fā)射波長(zhǎng)400～600 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為363 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為448 nm。

圖1 二氫吡啶乙腈溶液的激發(fā)、發(fā)射光譜圖

2.3 空白溶液的紫外光譜

配制1%磷酸乙腈溶液，按2.2項(xiàng)測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，空白溶劑在最大激發(fā)波長(zhǎng)363 nm、最大發(fā)射波長(zhǎng)為448 nm處無明顯吸收。

圖2 1%磷酸乙腈溶液的激發(fā)、發(fā)射光譜圖

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

移取2.1項(xiàng)下二氫吡啶對(duì)照品溶液L3適量，于Ex 233 nm、Em 464 nm下測(cè)定吸光度，重復(fù)6次，測(cè)得熒光強(qiáng)度，計(jì)算得RSD為0.61%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精確稱取2號(hào)飼料10 g，6份，置于100 mL棕色容量瓶中，按1.2.2中的供試品溶液的制備項(xiàng)處理，測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果6份測(cè)定值RSD為3.75%。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表

2.6 檢測(cè)限

取1%磷酸乙腈溶液適量，在Ex 233 nm、Em 464 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度，重復(fù)11次，計(jì)算SD。按公式（1）計(jì)算該方法的檢測(cè)限。

式（1）中，k為標(biāo)曲的斜率。計(jì)算得檢測(cè)限LOD為 0.013 μg/mL。

2.7 穩(wěn)定性考察

精確稱取2號(hào)飼料10 g，3份，置于100 mL棕色容量瓶中，按1.2.2中的供試品溶液的制備項(xiàng)處理，分別于0m、20、40、60、120 min測(cè)定其熒光強(qiáng)度，計(jì)算RSD[8]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)均小于2%，說明該對(duì)照品溶液2 h內(nèi)基本穩(wěn)定，不影響含量測(cè)定。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

精確稱取2號(hào)飼料5 g，6份，置于100 mL棕色容量瓶中，再分別加入二氫吡啶對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5 mL，按1.2.2中的供試品溶液的制備項(xiàng)處理，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)表

2.9 樣品測(cè)定

移取1.2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，以1%磷酸乙腈溶液為空白溶劑，在Ex 233 nm、Em 464 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算其含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定表

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑的選擇

二氫吡啶微溶于水，能溶于熱乙醇、乙腈[9]。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑[10]。本實(shí)驗(yàn)考察了二氫吡啶的1%甲酸乙腈、1%磷酸乙腈、1%氫氧化鈉乙腈溶液的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)：1%甲酸乙腈會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅，1%磷酸乙腈和1%氫氧化鈉乙腈溶液的熒光強(qiáng)度接近?？紤]到化合物的穩(wěn)定性，最終采用1%磷酸乙腈作為樣品提取溶劑。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

本實(shí)驗(yàn)分別掃描了二氫吡啶1%磷酸乙腈溶液及空白溶劑的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，二氫吡啶的最大紫外吸收波長(zhǎng)為230 nm、363 nm處，最大發(fā)射波長(zhǎng)為448 nm?？紤]溶劑干擾，確定了最大激發(fā)波長(zhǎng)為363 nm、發(fā)射波長(zhǎng)448 nm，作為定量測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 方法的優(yōu)勢(shì)

二氫吡啶作為普遍使用的飼料添加劑，一般的添加比例為0.01%～0.02%，現(xiàn)有測(cè)定方法主要是紫外分光光度法，靈敏度低，難以滿足飼料的測(cè)定要求[11]。二氫吡啶天然具有熒光，利用熒光分光光度法測(cè)定可以取得更低的檢測(cè)限，達(dá)到檢測(cè)飼料中微量添加二氫吡啶的要求。

4 結(jié)語

采用熒光分光光度法測(cè)定飼料中二氫吡啶的含量，方法簡(jiǎn)便快捷，數(shù)據(jù)可靠準(zhǔn)確，可作為飼料中二氫吡啶含量的測(cè)定方法。