高效液相色譜-柱后衍生法檢測大米中黃曲霉毒素B1方法分析

◎ 陳強勝

（懷寧縣市場監(jiān)督管理局稽查大隊，安徽 懷寧 246100）

黃曲霉毒素B1是黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物，毒性強，分布范圍廣，在很多食品中普遍存在，對人類健康的危害性極大。采用高效液相色譜-柱后衍生法對黃曲霉毒素B1有很好的檢測效果。高效液相色譜法是近年來發(fā)展起來的一種檢測方法，其原理是在高效液相色譜儀上添加柱后衍生系統(tǒng)分離，再用熒光檢測器測定。與其配套的柱后衍生系統(tǒng)有碘衍生化法、溴衍生化法及較為先進的電化學衍生化法和光化學衍生化法。當前，該方法大多用免疫親和柱來凈化、分離，其凈化效果優(yōu)異。

本文主要采用高效液相色譜-柱后衍生法檢測大米樣品中的黃曲霉毒素B1，用乙腈-水溶液的混合溶液提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過濾后經(jīng)液相色譜分離，柱后（碘試劑衍生），經(jīng)熒光檢測器檢測，外標法定量。

1 試劑和材料

甲醇（CH3OH），色譜純；乙腈（CH3CN），色譜純；氯化鈉（NaCI）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4）；磷酸二氫鉀（KH2PO4）；氯化鉀（KCI）；鹽酸（HCI）；TritonX-100；碘衍生使用試劑，碘（I2）；AFT B1標準品（C17H12O6，CAS號：1162-65-8），純度≥98%，經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

2 儀器

高效液相色譜儀，日本島津LC-20A，配有柱后衍生系統(tǒng)和熒光檢測器。

3 測定條件

流動相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）。低壓梯度洗脫條件：A，55%；B，45%。色譜柱，C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速，1.0 mL/min；柱溫，40 ℃；進樣量，40 μL；衍生溶液，0.05%碘溶液；衍生溶液流速，0.2 mL/min；衍生反應管溫度，70 ℃；激發(fā)波長，360 nm；發(fā)射波長，440 nm[1]。

4 分析步驟

按照國標GB 5009.22-2016方法和黃曲霉毒素B1免疫親和柱說明書處理大米樣品。①樣品提取，稱取5 g（m）樣品于50 mL離心管中，加入20.0 mL（V1）乙腈-水溶液，渦旋、混勻、離心后取上清液備用。②凈化，移取40 mL（V2）上清液，按照凈化操作步驟凈化，收集全部凈化液。要特別注意凈化柱需要回至室溫（25 ℃左右）樣品經(jīng)過親和柱時要嚴格控制流速（1～2滴/s），以使其充分反應吸附。③洗脫，取2 mL（V3）甲醇洗脫凈化柱，要嚴格控制洗脫速度（1～2 mL/min），再用真空泵抽干凈化柱并收集全部洗脫液。④上樣測定，經(jīng)色譜柱分離進入碘衍生系統(tǒng)。由熒光檢測器檢測[2]。

5 測定譜圖

用已知濃度的AFT B1標準品（C17H12O6，CAS號：1162-65-8）稀釋得到5個不同濃度梯度的AFT B1標準液作為標準品，將步驟4處理得到的分離提取液作為未知樣品。然后一并放入日本島津LC-20A（配有柱后衍生系統(tǒng)和熒光檢測器）的高效液相色譜儀中，并按照步驟3的測定條件進行測定。得到了很好的分離效果，譜圖峰沒有出現(xiàn)分叉、變形、拖尾現(xiàn)象，重現(xiàn)性好[3]。標準品譜圖（由于篇幅有限只列出其中一個標準品的譜圖）和樣品譜圖，分別如圖1、2所示。

圖1 標準品譜圖

圖2 樣品譜圖

6 結果計算

用5個不同濃度的標準品濃度和響應值繪制標準曲線，用此標準曲線加載樣品譜圖得到樣品濃度ρ=2.012 μg/kg。結合步驟4中樣品處理的質量和體積，代入公式（1）計算。

計算結果約為0.4 μg/kg

7 回收率試驗

將已知不含黃曲霉毒素B1的4份大米樣品中分別添加濃度為2.7、5.0、8.0、10.0 μg/kg 4個水平的黃曲霉毒素B1標準品，然后按照上述步驟和方法處理測定。得出平均回收率為88.95%

表1 添加回收率試驗表

8 總結

柱后碘衍生法檢出限為0.1 μg/kg。流動相在國標中給定的比例為A相68%、B相32%，但在實驗中發(fā)現(xiàn)按照這種比例本實驗室的液相色譜儀不能很好地分離標準物質，通過不斷調整發(fā)現(xiàn)A相55%、B相45%能夠取得很好的分離效果[4]。在該方法檢測過程中免疫親和柱的凈化提取尤為重要，使用前親和柱需要回至室溫（25 ℃左右），樣品經(jīng)過親和柱時候要嚴格控制流速以使其充分反應吸附，洗脫同樣要控制流速以減少目標物流失，造成檢驗結果出現(xiàn)大的偏差[5]。