李默楠，張婷婷，胡曉劍，劉木清

(復(fù)旦大學電光源研究所，先進照明技術(shù)教育部工程研究中心，上海 200433)

引言

螺旋藻是一種具有重要開發(fā)應(yīng)用價值的自養(yǎng)原核生物。 它具有光合效率高、生長繁殖快和對環(huán)境適應(yīng)性強等特點，是一種高效光合自養(yǎng)微藻[1]。螺旋藻對于生長環(huán)境有著一定的要求。當營養(yǎng)和溫度正常都適宜的情況下，光照就成為影響螺旋藻生長的一個重要因素，光照強度不同，將會直接影響到植物光合作用的速率，從而影響植物干物質(zhì)量的積累[2]。

LED光源由于光效高，體積小，光譜可控等優(yōu)點[3]，在螺旋藻的培養(yǎng)和養(yǎng)殖過程中有著廣泛的利用前景。但植物感知光照的方式與人眼不同，植物通過吸收光子來參與光合作用，因此我們不能用照度值作為衡量植物光照強度的指標。

Xue等[4]的實驗中按照光功率的從小到大的變化將螺旋藻的生長情況分為光限制區(qū)，光中間區(qū)、光飽和區(qū)和光抑制區(qū)，其中螺旋藻在光限制區(qū)內(nèi)的光能利用率最高。Tian和Buso[5]在實驗中發(fā)現(xiàn)單色紅光比白色熒光燈更能夠促進螺旋藻的生長。本實驗利用LED光源光譜可控的特點探究了螺旋藻在不同光照強度和不同光譜下的生長狀況。

1 實驗材料

本次實驗采用藻種鈍頂螺旋藻和Spirulina medium培養(yǎng)基培養(yǎng)濃藻液并進行實驗。

1)藻種。本實驗藻種為鈍頂螺旋藻，由中國科學院野生生物物種藻種庫提供。

2)培養(yǎng)基。本實驗采用Spirulina medium培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由中國科學院野生生物物種藻種庫提供。培養(yǎng)基成分為: NaHCO3，13.61 g/L；Na2CO3，4.03 g/L；K2HPO4，0.50 g/L；NaNO3，2.50 g/L；K2SO4；1.00 g/L；NaCl，1.00 g/L；MgSO4·7H2O，0.20 g/L；CaCl2·2H2O，0.04 g/L；FeSO4·7H2O，0.01 g/L；A5(Trace mental solution)，1 ml/L。其中微量元素溶液A5組成為：H3BO3，2.86 g/L dH2O；MnCl2·4H2O，1.86 g/L dH2O；ZnSO4·7H2O，0.22 g/L dH2O；Na2MnO4·2H2O，0.39 g/L dH2O；CuSO4· 5H2O，0.08 g/L dH2O；Co(NO3)2·6H2O，0.05 g/L dH2O。

2 實驗數(shù)據(jù)處理方式

1)光量子流密度。植物照明中，由于各種植物對不同波長的光敏感性不同，通常用光量子流密度(PPFD)代替照度作為光照強度的指標。光量子流密度指單位時間內(nèi)落到單位面積上400～700 nm的光子數(shù)，單位是μmol·m-2·s-1。當一個光源用于植物照明時，光源輻射出來的恒定速率的光子，并向四面八方傳播，當光源離植物越近，就有越多的光子能夠到達植物的葉片上[6]。

2)光密度值(optical density，以下簡稱OD值)，表示被檢測物吸收掉的光密度，是入射光強度與透射光強度之比值的常用對數(shù)值。一般用OD值表示，OD=lg(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值。因此光密度值又叫通光率。根據(jù)Xue等[4]的研究表明，在一定的條件下，螺旋藻的生物量在560 nm處波長下的OD值具有良好的線性關(guān)系，一般可用 OD值表征螺旋藻干物質(zhì)含量的積累，通過測量藻液的 OD 值可以較為直觀地反映出螺旋藻的生長情況[7]。

3)OD值的測量。用攪拌棒將藻液進行攪拌均勻，取出部分藻液和清水分別加入比色皿中，用722紫外分光光度計在560 nm處進行測量比較，得到其OD值。當藻液濃度過高時，應(yīng)將藻液按一定比例進行稀釋，以保證測量OD值在0.1～0.6之間。OD值的測量于每天下午1：00開始進行，按順序分別對各組螺旋藻測量，每組波長組合共記錄13組數(shù)據(jù)。

3 培養(yǎng)和實驗方法

螺旋藻光照實驗示意圖見圖1，實驗實景圖見圖2。

1)初級培養(yǎng)。取200 mL的消毒后的錐形瓶，向其中加入100 ml的Spirulina medium培養(yǎng)基，并取出一份藻種(15 mL)加入錐形瓶中。在26 ℃，200 μmol·m-2·s-1的環(huán)境下進行通氣擴大培養(yǎng)，光照黑暗時間比為12∶12。培養(yǎng)7～10天后得到濃藻液。

2)次級培養(yǎng)。取1 000 mL的消毒后的錐形瓶，向其中加入500 ml的Spirulina medium培養(yǎng)基，同時取出初級培養(yǎng)得到的藻液100 mL左右，加入錐形瓶，在26 ℃，200 μmol·m-2·s-1的環(huán)境下進行通氣擴大培養(yǎng)，光照黑暗時間比為12∶12。培養(yǎng)7～10天后得到濃藻液。

圖1 螺旋藻光照實驗示意圖Fig.1 The diagram of Spirulina illumination experiment

圖2 螺旋藻光照實驗實景圖Fig.2 The photo of Spirulina illumination experiment

3)不同光照強度對螺旋藻生長的影響實驗。取1 000 mL的消毒后的錐形瓶，向其中加入500 mL的Spirulina medium培養(yǎng)基，同時取出次級培養(yǎng)得到的藻液100 mL左右，加入錐形瓶，搖晃均勻后等量均分后放入錐形瓶中，使各組螺旋藻的OD值大致相同。將各組的螺旋藻放置在光量子密度分別為142 μmol·m-2·s-1，250 μmol·m-2·s-1，340 μmol·m-2·s-1，450 μmol·m-2·s-1，540 μmol·m-2·s-1，900 μmol·m-2·s-1，1200 μmol·m-2·s-1的光照培養(yǎng)架上進行對照實驗。為了防止其他顏色的光照以及PWM驅(qū)動方式的脈沖光照對螺旋藻生長帶來影響，實驗均采用625 nm的單色紅光，驅(qū)動方式均為直流驅(qū)動，即光照均為直流光，培養(yǎng)溫度為26 ℃，光照黑暗時間比為12∶12，通氣培養(yǎng)時間為13天并記錄數(shù)據(jù)。

4)不同光譜對螺旋藻生長的影響實驗。取1 000 mL的消毒后的錐形瓶，向其中加入500 mL的Spirulina medium培養(yǎng)基，同時取出次級培養(yǎng)得到的藻液100 ml左右，加入錐形瓶,搖晃均勻后等量均分后放入錐形瓶中，通過測量和調(diào)整使各組螺旋藻的OD值大致相同。光量子通量密度值均為200 μmol·m-2·s-1,紅藍光質(zhì)比為1∶1將各組的螺旋藻放置在不同的光譜組合下的光照培養(yǎng)架上進行對照實驗。各光譜組合如下：(450～465 nm)+(620～625 nm)；(465～470 nm)+(650～660 nm)；(450～465 nm)+(650～660 nm)；(465～470 nm)+(620～625 nm)；(450～465 nm)+(660～670 nm)；單色紅光(620～625 nm)；單色藍光(450～465 nm)；白色熒光燈組。

驅(qū)動方式均為直流驅(qū)動，即光照均為直流光，培養(yǎng)溫度為26 ℃，光照黑暗時間比為12∶12，通氣培養(yǎng)時間為13天并記錄數(shù)據(jù)。

4 結(jié)果與討論

1)螺旋藻在不同光照強度下的生長情況。根據(jù)不同光照強度培養(yǎng)下12天以后所得到得螺旋藻最終OD值，可以繪制出螺旋藻在不同PPFD下生長的情況(如圖3所示)。

圖3 螺旋藻在不同光照強度下的生長ODFig.3 The OD of Spirulina under different light intensity

由圖3可以發(fā)現(xiàn)不同的光量子流密度下對螺旋藻生物質(zhì)量的增長作用不同。當培養(yǎng)時間，溫度等其他條件相同時，若光照強度小于540 μmol·m-2·s-1，螺旋藻的產(chǎn)量隨著光量子流密度的增加而增加，且螺旋藻的產(chǎn)量與光量子流密度大致呈對數(shù)形式，即隨著光量子流密度的增加，螺旋藻產(chǎn)量的增加量逐漸減少；而當光量子流密度超過540 μmol·m-2·s-1時，盡管光量子流密度進一步增加，但螺旋藻的產(chǎn)量不再增加。這表明在光量子流密度尚未達到飽和光量子流密度之前，光量子流密度是決定螺旋藻的生長速率的主要原因。

植物的飽和光量子流密度是指植物光合作用強度達到最大值時的光量子流密度，不同的藻種和不同的接種濃度，各有其不同的飽和光量子流密度。在相同的光輻射實驗條件下，由圖3 中光量子流密度對螺旋藻比生長速率的影響可知，當光量子流密度超過光飽和點以前，OD-PPFD曲線呈陡峭上升趨勢，螺旋藻的最終產(chǎn)量隨著 PPFD的增大顯著增加，表明螺旋藻生長對光輻射強度十分敏感，當營養(yǎng)底物和環(huán)境溫度不是螺旋藻生長限制因子時，螺旋藻的生長主要受光量子流密度的控制。如圖3所示，在本實驗裝置中，螺旋藻生長的飽和光量子流密度在 540 μmol·m-2·s-1出現(xiàn)，此時，螺旋藻的比生長速率趨于恒定值，這是因為在高光強下，光合作用出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象時，植物會利用葉黃素循環(huán)來促進非光化學淬滅對過量光能的耗散，同時通過建立跨類囊體膜的質(zhì)子梯度等方式建立新的光形態(tài)，保護光合作用免受損傷[8]。

2)螺旋藻在不同光譜組合下的生長情況。根據(jù)在不同光譜組合培養(yǎng)下12天以后所得到得螺旋藻最終光密度值，可以繪制出螺旋藻在不同光譜組合下生長的情況如圖4所示。

圖4 不同光譜組合條件下螺旋藻生長的情況Fig.4 The OD of Spirulina under different light spectrum

從圖4中可以發(fā)現(xiàn)不同的光譜條件下對螺旋藻生物質(zhì)量的生長作用不同。在(450～465 nm)+(650～660 nm)波長組合下，螺旋藻的最終產(chǎn)量最高，比其他幾組生物質(zhì)量高14%～43%。同時當藍光波長相同時，紅光波長越長，螺旋藻生長的速度越快，最后的螺旋藻的干物質(zhì)含量也越多。而當紅光波長相同時，改變藍光的波長螺旋藻干物質(zhì)含量差異相對較小，這表明波長在450～470 nm附近的藍光對螺旋藻的生長速率影響比紅光的作用小。而螺旋藻在熒光燈組照射下比在其他所有的LED波長組合下最終積累的物質(zhì)的量都要少，比最高LED波長組合(450～465 nm)+(650～660 nm)少43%，比最低LED波長組合[單色藍光(450～465 nm)]少15%，這是因為螺旋藻的反射光譜大部分集中在綠色區(qū)域(550 nm處)，和熒光燈的光譜有著大量的重合部分，浪費了許多熒光燈發(fā)出的光能。

5 實驗結(jié)論

我們通過對螺旋藻在不同光照條件下生長情況的研究得到了以下結(jié)論：

1)在其他條件相同時，在一定的光照強度范圍內(nèi)，螺旋藻的生長速度隨著光量子流密度的增加大致呈對數(shù)形式增加，即光照強度越高，螺旋藻生長速率增加的越慢。

2)螺旋藻的生長對光照的響應(yīng)有一個飽和值。即當其他條件不變時，如果光照強度超過螺旋藻的光照響應(yīng)飽和值，即使光照強度繼續(xù)增加，螺旋藻的產(chǎn)量幾乎不變。這是由于較強的光照存在著光抑制作用，降低植物光合作用的效率與生長，同時較強的光照使螺旋藻濃度增加，使得在植物溶液中的光衰更加明顯，下層的螺旋藻難以獲得更加合適的光照條件。

3)在光譜實驗中，我們發(fā)現(xiàn)使用紅藍光的LED照明系統(tǒng)明顯要由于傳統(tǒng)的熒光燈植物照明系統(tǒng)，而且光譜表現(xiàn)組合最好的是(450～465 nm)+(650～660 nm)組合，同時我們也發(fā)現(xiàn)紅光對于螺旋藻生長速率和產(chǎn)量的影響要明顯高于藍光。