李四維 吳晶晶 張賽文 李恒 陳丹妮 于斌 屈軍樂

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室,深圳 518060)(2018年3月30日收到;2018年5月16日收到修改稿)

1 引 言

在生命科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的今天,為了進一步了解和研究生命體之間的相互作用、疾病的產(chǎn)生機理,人們迫切需要獲得更加精確的細胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息.但是,由于光學(xué)衍射極限的存在,常規(guī)的光學(xué)顯微鏡的分辨率只能達到200 nm左右,難以滿足現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的需要.近年來,單分子定位超分辨熒光顯微技術(shù)的出現(xiàn),如光敏定位顯微術(shù)(photoactivated localization microscopy)[1]、隨機光學(xué)重建顯微術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy)[2]、熒光光敏定位顯微技術(shù)( fluorescence photoactivation localization microscopy)[3]等,它們克服了衍射極限,達到20 nm的橫向分辨率和100 nm的軸向分辨率,有力地推動了生命科學(xué)的發(fā)展,廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域[4?8].雖然單分子定位超分辨成像系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)超分辨成像,但是較低的軸向分辨率仍有待改善.為了克服這一問題,文獻[9,10]在光路中加入柱面鏡,將單分子定位顯微的景深擴展到600 nm;Pavani和Piestun[11]在探測光路中引入特殊相位,將點擴散函數(shù)變?yōu)殡p螺旋的形式,實現(xiàn)熒光分子在軸向±2μm范圍內(nèi)的三維定位;Juette等[12]將探測光路分光并引入光程差,通過計算兩路光的光程差來獲得熒光分子的軸向位置,使成像景深達到1μm.雖然這些方法顯著地提升了單分子定位超分辨成像系統(tǒng)的成像景深,但對于厚度約10μm的完整細胞而言,現(xiàn)有的方法還不能滿足多分子追蹤時的大景深要求.為了獲取整個細胞的信息,傳統(tǒng)方法是對同一細胞的不同軸向位置的層面進行一系列掃描探測,再由相關(guān)算法將所有層面信息按照軸向位置排序合成,還原出整個細胞內(nèi)的分子信息.但是,在三維掃描的過程中,不同層面的信息會相互影響,產(chǎn)生背景噪聲和熒光漂白,降低分辨率.一些研究者提出使用變形光柵對樣品進行多層面探測[13?15],但由于變形光柵的能量主要分布在衍射的0級與±1級,故該方法最多只能對細胞內(nèi)九個不同層面同時成像,因此,在實現(xiàn)大的軸向探測范圍的同時無法保持較高的軸向分辨率.Yu等[16]提出一種達曼變形光柵(distorted dammann grating,DDG),它通過達曼編碼的方式將大部分的光強均勻分布在需要的幾個衍射級上,有效地提高了傳統(tǒng)變形光柵的高衍射級效率.但是,達曼編碼的方式對單個周期中相位分布的寬度有著嚴格的要求,無法適用于空間光調(diào)制器(spatial light modulators,SLM).針對這一問題,Zhu等[17]提出了一種能夠適用于SLM的多值純相位光柵(multi-value pure-phase grating,MVPPG)編碼方法.在一個周期中,它由多個相位值構(gòu)成,每個相位分布具有相同的寬度,通過選取合適的相位值,可以獲得與達曼編碼一樣的效果.在此基礎(chǔ)上,我們將MVPPG和DDG的設(shè)計思路相結(jié)合,提出一種變形多值純相位光柵(distorted multi-value pure-phase grating,DMVPPG),它不僅具有與DDG相同的特性,并且解決了其無法適用于SLM的缺陷,減少了光柵加工的成本與時間,降低了使用的難度.另外,通過波前編碼技術(shù)將雙螺旋相位引入DMVPPG中,獲得具有復(fù)合功能的全息相位片.這種新型的全息相位片可以將細胞樣品中不同層面的分子信息以雙螺旋點擴散函數(shù)(double-helix point spread function,DH-PSF)[18]的形式成像在同一像平面的不同位置,并且相互之間的光強相近.經(jīng)過理論以及數(shù)值模擬證明,在納米分辨多分子追蹤系統(tǒng)中,相比于變形光柵,這種新型全息相位片可以獲得更高的清晰度和更多細胞層的信息,有效地提高單分子定位顯微鏡的成像深度.

2 原理和方法

2.1 雙螺旋點擴散函數(shù)

DH-PSF是一種特殊的點擴散函數(shù),在其傳播橫截面上,光強分布呈現(xiàn)為兩個相對的旁瓣,隨著物體在軸向離焦距離的變化,原本水平方向上的兩個旁瓣會發(fā)生旋轉(zhuǎn)和縮放,如圖1所示.而且旋轉(zhuǎn)的角度與離焦距離成正比關(guān)系,如圖2所示.基于這一特性,DH-PSF可以用來對三維空間中的稀疏粒子進行橫向和軸向的高精度定位[19,20].傳統(tǒng)方法獲得DH-PSF的過程較為復(fù)雜,需要尋找位于拉蓋爾高斯(Laguerre-Gauss,LG)模式平面上特定直線上的LG模式,將這些模式進行線性疊加得到DH-PSF[21],并對其相位分布進行迭代優(yōu)化[22],來獲得高效率的相位模板.本文中使用一種簡單方法[23]設(shè)計DH-PSF.,基于渦旋的傳播性質(zhì)和螺旋光的基礎(chǔ)理論[24],把DH-PSF解析為光瞳平面沿直徑方向上的渦旋光的疊加,其數(shù)學(xué)表達式如下:

式中i2=?1;(x,y)為相位片的光瞳坐標(biāo);(xk,yk)為第k個螺旋光的相位奇點的坐標(biāo);Rdh為光瞳半徑;Ndh為螺旋光的數(shù)目,當(dāng)Ndh增加時,光強更加集中在兩個旁瓣上;M為(Ndh?1)/2;d為相鄰的渦旋奇點的距離,當(dāng)d增大時,兩個旁瓣的相對距離會隨之增大.相比于傳統(tǒng)方法,該方法大幅降低了DH-PSF相位片的設(shè)計難度,并且具有更高的定位精度和效率.

圖1 DH-PSF相位片和DH-PSF在不同軸向位置的光強分布Fig.1.DH-PSF phase mask and DH-PSF at different axial planes.

圖2 DH-PSF兩個旁瓣旋轉(zhuǎn)角度與z軸位置的關(guān)系曲線Fig.2.The relationship between the two lobes rotation angles of DH-PSF and the position of z axis.

2.2 變形多值純相位光柵

DMVPPG是通過多值相位編碼技術(shù),對傳統(tǒng)變形光柵[25]進行相位編碼.一方面,DMVPPG與傳統(tǒng)的變形光柵一樣,具備菲涅耳波帶片的透鏡作用,在不同衍射級具有不同焦距的透鏡效應(yīng);另一方面,對于傳統(tǒng)的變形光柵,入射光能主要分布在低衍射級上,高衍射級上的信號難以被探測,而DMVPPG在需要的幾個衍射級上的光強分布趨于一致,從而能夠探測到更高衍射級的信息.本文設(shè)計的DMVPPG具有純相位結(jié)構(gòu),相比振幅光柵,其效率大大提高.其透過率函數(shù)可表達為

式中(x,y)為DMVPPG為入瞳面的坐標(biāo);Λ為x方向上光瞳孔徑中心的光柵周期;

R為DMVPPG的光瞳半徑,n0是聚焦區(qū)域的折射率,K是常數(shù),決定變形光柵不同衍射級的焦距大小,當(dāng)光柵緊貼透鏡時,K為聚焦透鏡的數(shù)值孔徑,W20為光柵的離焦系數(shù).m為衍射級,其對應(yīng)的衍射系數(shù)Cm表示如下:

式中,N是一個周期內(nèi)被劃分的塊數(shù);φn是第n塊的相位分布值它的選取直接決定了衍射級之間光強分布.因此,通過最優(yōu)化算法[26],可以尋找合適的相位值來使得所需要的β個衍射級的光強分布相當(dāng),即|Cm|2=|C0|2.在實際光柵相位生成中,根據(jù)(3)式計算得到φn,并生成一個二值相位光柵,在一個歸一化的周期內(nèi),其光柵條紋的每個離散的相位所占寬度為1/N.并引入(1)式中相同的離焦相位ψw,其透過率表達式如下:

M0為傅里葉級數(shù)截斷級,其m級的衍射系數(shù)Am為

取Tgrating(x,y)的實數(shù)部分,并將數(shù)值大于0的部分賦值為1,數(shù)值小于0的部分賦值為?1,這樣可以得到一個黑白相間的光柵相位分布.最后,將φn的值依序賦值到黑和白的相位區(qū)域內(nèi),將原本的二值相位轉(zhuǎn)換為多值相位的形式,如圖3所示.

圖3 變形多值純相位光柵的設(shè)計方法Fig.3.The design method of DMVPPG.

圖4 多值純相位光柵的相位分布和切面的結(jié)構(gòu) (a)多值純相位光柵的相位分布;(b)多值純相位光柵在切面上的結(jié)構(gòu)Fig.4.Phase distributions of MVPPG and structure in the section:(a)Phase distributions of MVPPG;(b)the structure of MVPPG in the section.

圖5 變形多值純相位光柵的相位分布及其成像原理 (a)一維變形多值純相位光柵的相位分布;(b)一維變形多值純相位光柵成像原理;(c)二維變形多值純相位光柵;(d)二維變形多值純相位光柵成像原理Fig.5.Phase distributions and imaging principle of DMVPPG:(a)The phase distribution of 1×5 DMVPPG;(b)the imaging principle of 1D-DMVPPG;(c)the phase distribution of 5×5 DMVPPG;(d)the imaging principle of 2D-DMVPPG.

當(dāng)DMVPPG透過率函數(shù)中離焦系數(shù)W20=0時,光柵退化為MVPPG.在一個歸一化周期內(nèi),光柵被等分為N個部分,每個部分具有不同的相位值φn,如圖4(a)所示,其切面結(jié)構(gòu)原理圖如圖4(b)所示;當(dāng)W20/=0,MVPPG中加入了離焦相位ψw,其相位分布如圖5(a)所示.相位條紋產(chǎn)生彎曲,在不同衍射級上引入了不同焦距的透鏡效應(yīng),其m衍射級對應(yīng)的焦距這一特性使得樣品內(nèi)不同軸向位置的信息(相鄰的兩個樣品面的間隔為Δz)從左到右的成像在同一平面,其原理如圖5(b)所示.如果需要獲得更多樣品層的信息,可以簡單地將一個1×Mx的DMVPPG和一個1×My的DMVPPG正交重疊,生成一個Mx×My階的二維DMVPPG,為了保持兩個相鄰樣品面之間的距離相等,其離焦系數(shù)W20,x/W20,y應(yīng)等于Mx或者1/My,其相位如圖5(c)所示.當(dāng)樣品面位于軸上不同位置時,經(jīng)3×3的DMVPPG和透鏡成像在探測面,其成像位置與物方樣品位置之間的關(guān)系如圖5(d)所示.當(dāng)樣品面與系統(tǒng)的物方焦平面重合時,即Z=0,其成像位于探測面的正中心;當(dāng)樣品面距離系統(tǒng)的物方焦面的距離為?4Δz時,其成像在探測面的左上角.因此,DMVPPG可以不依靠軸向掃描來實現(xiàn)軸向大范圍的高分辨率三維成像,可以廣泛地應(yīng)用到活細胞三維顯微成像、納米尺度三維單分子定位及成像等領(lǐng)域.

3 新型全息相位片

新型全息相位片是通過波前編碼技術(shù),將DMVPPG與DH-PSF結(jié)合產(chǎn)生的,其相位分布為

它是由雙螺旋相位片的相位φdh與變形多值純相位光柵的相位φdmvppg線性疊加而成,這種全息相位片可以將不同樣品面的分子信息以雙螺旋點擴散函數(shù)的形式成像在同一探測面上不同位置,并且它們之間的光強趨于一致.將其放入顯微成像系統(tǒng)中,其工作光路如圖6所示.反射式的SLM位于4f系統(tǒng)的傅里葉面位置,實驗中,全息相位片顯示在SLM的液晶面板上,通過相機一次曝光,可以實現(xiàn)對細胞內(nèi)不同深度的分子信息并行成像;根據(jù)光柵參數(shù)的不同,可以對光學(xué)系統(tǒng)的景深進行不同倍率的擴展;同時,它兼具雙螺旋點擴散函數(shù)的性質(zhì),可以對景深范圍內(nèi)的離散的分子進行納米精度的三維定位.因此,新型的全息相位片可以將原有的探測深度延展數(shù)倍,有利于對完整細胞中的分子結(jié)構(gòu)進行三維探測,減少多次探測所帶來的誤差,提高了單分子定位的定位精度.

圖6 基于全息相位片的大景深三維熒光顯微成像系統(tǒng)Fig.6.Large depth of field 3D fluorescence microscopy imaging system based on a new type holographic phase mask.

4 數(shù)值模擬與結(jié)果分析

圖7 二維變形多值純光柵、雙螺旋相位片以及全息相位片的相位分布 (a)二維變形多值純光柵的相位分布;(b)雙螺旋相位片的相位分布;(c)全息相位片的相位分布Fig.7.Phase distributions of 2D-DMVPPG,DH-PSF phase mask and the new tape holographic phase mask:(a)The phase distribution of 2D-DMVPPG;(b)the phase distribution of DH-PSF phase mask;(c)the phase distribution of the new tape holographic phase mask.

為了證明這種新型全息相位片可以有效提高單分子定位顯微系統(tǒng)的探測景深,根據(jù)圖6中的光路進行數(shù)值模擬.首先,設(shè)計生成5×5的DMVPPG,如圖7(a)所示,像素數(shù)為600×600,像素尺寸為10μm;單個周期的劃分塊數(shù)N=4,對應(yīng)的相位值φn分別為1.1165π,0.7761π,1.8472π和0.7761π;K=0.4841;周期Λ=200μm;x,y方向的離焦系數(shù)分別為W20,x=10λ,W20,y=50λ.接著根據(jù)(1)式生成雙螺旋相位,其像素數(shù)和像素尺寸與DMVPPG相同,如圖7(b)所示,其中Ndh=9,d=0.7Rdh,旋轉(zhuǎn)180°對應(yīng)的軸向范圍為1.125μm.最后根據(jù)波前編碼技術(shù)將兩者相位結(jié)合,生成新的全息相位片,如圖7(c).將全息模版放置在焦距f=20 cm的4f系統(tǒng)中,在入射波長λ=480 nm條件下根據(jù)系統(tǒng)參數(shù),可以計算出相鄰衍射級對應(yīng)樣品面之間的距離Δz=0.5μm,匹配雙螺旋最佳定位精度的旋轉(zhuǎn)范圍為?40°—40°.

在物方軸上的不同位置,依次模擬點光源來作為細胞中的分子,兩個相鄰的點光源距離為0.5μm,經(jīng)4f系統(tǒng)后成像在CCD的探測面上,根據(jù)光源的不同的軸向位置,在焦平面的對應(yīng)區(qū)域形成雙螺旋點擴散函數(shù),如圖8所示,其中虛線區(qū)域為對應(yīng)雙螺旋點擴散函數(shù)的放大圖.當(dāng)點光源位于4f系統(tǒng)透鏡的前焦點處,探測面上形成清晰的雙螺旋點,位于整個視場中心,如圖8(a)所示,雙螺旋的兩個旁瓣保持水平.當(dāng)點光源與前焦點的距離為0.5Δz時,其恰好位于物方相鄰兩個成像層面的中間位置,因此衍射零級和衍射+1級上會同時出現(xiàn)光強相等的雙螺旋點,它們分別順時針旋轉(zhuǎn)40°和逆時針旋轉(zhuǎn)40°.如圖8(b)所示.當(dāng)光源距離焦點距離?12Δz時,雙螺旋點分別出現(xiàn)在視場的左上角,如圖8(c)所示.通過上面的模擬結(jié)果,可以證明設(shè)計出的全息相位片能夠達到理論上的最大擴展深度,有效地將系統(tǒng)探測范圍提升到±6μm.相比于傳統(tǒng)的多焦面超分辨單分子定位熒光顯微系統(tǒng),大幅提高了樣品的成像層數(shù),將樣品內(nèi)相鄰的兩個探測面的間隔縮小到0.5μm,提高了軸向的分辨率.最后,將每個衍射級的強度進行統(tǒng)計,并進行歸一化計算,如圖9所示.可以看出多值相位編碼有效地將光強均勻分布到所需要的25個衍射級上,提高了高衍射級的光強分布.雖然衍射級之間的光強并沒有達到理論上的一致,經(jīng)分析可能是由于相位片在構(gòu)成像素數(shù)較少的情況下,隨著離焦因子的增大,DMVPPG的像素化的相位分布會與理論值存在一定誤差,光強在不同衍射級上的分布會受到影響,因而,隨著構(gòu)成光柵的像素數(shù)增加,像素尺寸減少,并選擇合適的離焦因子,光柵的均勻性會隨之改善.模擬結(jié)果表明這種新型全息相位片可以實現(xiàn)對細胞的多層面上的分子同時成像,并將系統(tǒng)的普通點擴散函數(shù)轉(zhuǎn)換為雙螺旋的形式,通過雙高斯擬合定位算法,可以實現(xiàn)精度在10 nm的單分子定位,提高了相鄰細胞面之間離焦的分子的定位精度.如將上述全息相位模板應(yīng)用到單分子定位超分辨熒光顯微中,結(jié)合熒光分子的稀疏激發(fā),可以同時對整個細胞內(nèi)多個分子進行實時追蹤和定位.

圖8 點光源處于不同軸向位置的成像結(jié)果 (a)新型全息相位片的相位分布;(b)點光源位于z=0.5Δz位置的成像結(jié)果;(c)點光源位于z=?12Δz位置的成像結(jié)果Fig.8.Imaging results of point light sources at different axial positions:(a)The image result as the point source in the z=0;(b)the image result as the point source in the z=0.5Δz;(c)the image result as the pointsource in the z= ?12Δz.

圖9 探測面上不同衍射級光強分布Fig.9.The intensity distribution of different diffraction orders in the detection plane.

5 總 結(jié)

本文設(shè)計的新型全息相位片在擴展了探測景深的同時有效地提高了軸向的分辨率,并且將普通的點擴散函數(shù)轉(zhuǎn)換為雙螺旋的形式,提高了單分子定位的三維定位精度.將這種新型全息相位片通過SLM顯示應(yīng)用到單分子定位顯微鏡中,可以實現(xiàn)對整個細胞中多個分子的追蹤和高精度定位.一方面,多值相位編碼可以使得所需求的衍射級上的能量分布趨于一致,進一步提高了衍射效率,彌補了傳統(tǒng)變形光柵高衍射級的信號光太弱而無法探測的問題;另一方面,它可以有效地通過SLM來實現(xiàn),省去了光柵加工的成本與時間.模擬結(jié)果表明:這種方法能夠?qū)⒃镜膯畏肿佣ㄎ伙@微鏡成像深度擴大數(shù)倍,并且能量利用率高,擴展了單分子定位顯微的景深;同時,為完整細胞內(nèi)多個生物分子實時變化的觀察和追蹤提供一個更好的方案,對研究生物學(xué)中的分子機制有著重要的意義.