李金艷，胡榮靜，曾 敏

(重慶市中醫(yī)院：1.婦產(chǎn)科；2.病理科 400021)

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)增加新生兒的病死率，并且新生兒在成年后糖耐量異常及心血管疾病的發(fā)病率也隨之增高。FGR的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。母胎間葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)異?？赡芘cFGR的發(fā)生有著密切關(guān)系。葡萄糖是生長(zhǎng)發(fā)育的胎兒和胎盤(pán)中有氧代謝的必需物質(zhì)[1]。葡萄糖從母體血液中通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter,GLUT)介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)。GLUT是一個(gè)蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)共有14個(gè)異構(gòu)體，主要負(fù)責(zé)葡萄糖通過(guò)細(xì)胞膜的雙脂質(zhì)層進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。人類(lèi)胎盤(pán)滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中GLUT的主要成員包括GLUT1、GLUT3和GLUT4[2]。GLUT1主要分布在哺乳動(dòng)物胎盤(pán)的合體滋養(yǎng)層，在整個(gè)妊娠期間呈高表達(dá)[3-4]。GLUT3通常在代謝率高的組織如受精卵植入前胚胎中的神經(jīng)元和滋養(yǎng)外胚層中有表達(dá)[5]。GLUT3對(duì)葡萄糖有著較高的親和力，比GLUT1和GLUT4具有更高的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力[6]。GLUT4是對(duì)胰島素敏感的異構(gòu)體，GLUT4主要負(fù)責(zé)妊娠早期在胰島素存在條件下能夠促進(jìn)葡萄糖母胎間轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明FGR與先兆子癇有著相同的胎盤(pán)病因?qū)W，即胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞不充分生長(zhǎng)，導(dǎo)致子宮胎盤(pán)血流灌注減少使胎盤(pán)長(zhǎng)期處于慢性缺氧狀態(tài)從而引起FGR的發(fā)生。本文研究FGR胎盤(pán)中GLUT3的表達(dá)情況，以明確其作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1-11月在本院住院分娩的FGR孕婦15例作為研究對(duì)象，年齡(27.3±2.4)歲,孕周(38.8±1.6)周，無(wú)其他產(chǎn)科的合并癥及并發(fā)癥。FGR的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版。同期住院分娩的正常孕婦15例作為對(duì)照，無(wú)任何妊娠期合并癥和并發(fā)癥，年齡(26.8±1.6)歲，孕周(39.6±1.8)周。

1.2藥品和試劑 兔抗人GLUT3多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯示劑購(gòu)自武漢博士德生物公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、PVDF膜、ECL發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；GLUT3引物由上海生工設(shè)計(jì)引物序列并合成引物。

1.3方法

1.3.1測(cè)定新生兒、胎盤(pán)質(zhì)量及標(biāo)本采集 經(jīng)陰道或剖宮產(chǎn)分娩的新生兒，娩出后擦干全身的羊水及血液稱(chēng)取體質(zhì)量并記錄。胎盤(pán)娩出后稱(chēng)取質(zhì)量并記錄。在胎盤(pán)中央靠近臍帶處取大小為2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm三角形的胎盤(pán)組織，測(cè)定胎盤(pán)組織厚度，將剪下胎盤(pán)分為兩個(gè)水平片段，底蛻膜為胎盤(pán)母體面，頂部絨毛膜表面為胎兒面，分別用于以下研究。

1.3.2免疫組化檢測(cè)GLUT3的表達(dá) 胎盤(pán)母體面和胎兒面常溫固定于4%多聚甲醛中24 h后，常規(guī)石蠟包埋并連續(xù)切片。具體操作步驟如下：胎盤(pán)切片用二甲苯脫蠟至水，用檸檬酸緩沖液高溫進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水滅活內(nèi)源性酶，山羊血清封閉后加入一抗GLUT3，工作液濃度為1∶50,4 ℃過(guò)夜。加入SABC免疫組化試劑盒中生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，加入HRP標(biāo)記鏈親和素，DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片。結(jié)果判定：以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，陰性反應(yīng)為除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞核和胞漿內(nèi)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。采用Image-Pro Plus 6.0軟件系統(tǒng)對(duì)GLUT3在胎盤(pán)組織的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)完整不重疊的高倍鏡視野(×400)下陽(yáng)性反應(yīng)面積和陽(yáng)性積分光密度，計(jì)算出平均光密度值(AOD),以每例10個(gè)視野AOD的平均值作為該例的測(cè)量值。

1.3.3RT-qPCR 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取胎盤(pán)母體面和胎兒面總RNA，cDNA的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作。人GLUT3基因引物由上海生物工程合成，上游引物5′-CAG GCA CAC GGT GCA GAT AG-3′,下游引物5′-GCA GGC TCG ATG CTG TTC AT-3′。反應(yīng)體系20 μL。退火溫度為65 ℃，38次循環(huán)。用GAPDH作為內(nèi)參照。每個(gè)樣品復(fù)孔3次，最后分析溶解曲線(xiàn)，用GLUT3與內(nèi)參基因GAPDH基因表達(dá)量的比值來(lái)表示相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4Western blot 胎盤(pán)組織稱(chēng)重后剪細(xì)，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用勻漿機(jī)勻漿后，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用細(xì)胞裂解液配平各組之間蛋白濃度。加熱使蛋白變性。蛋白樣品上樣量為12 μL，行SDS-PAGE膠電泳分離，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜30 min后，放入GLUT3抗體(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜。PVDF轉(zhuǎn)至二抗羊抗兔IgG抗體(1∶6 000)室溫孵育2 h。β-actin作為內(nèi)參。ECL發(fā)光液發(fā)光顯影檢測(cè)目的蛋白條帶的變化情況。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)軟件分析目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1兩組新生兒出生體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量、胎盤(pán)厚度 FGR組新生兒出生體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量、胎盤(pán)厚度明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組新生兒出生體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量、胎盤(pán)厚度比較

2.2GLUT3在胎盤(pán)組織表達(dá)情況 GLUT3在胎盤(pán)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞上均有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。與對(duì)照組比較，F(xiàn)GR組胎盤(pán)組織母體面GLUT3表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。FGR組胎盤(pán)組織母體面GLUT3的AOD值(0.451±0.121)明顯高于對(duì)照組(0.277±0.093)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GLUT3在FGR胎盤(pán)組織胎兒面AOD值(0.252±0.102)與對(duì)照組(0.246±0.086)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)兩組胎盤(pán)組織GLUT3 mRNA表達(dá)變化

A:Western blot蛋白條帶；B：兩組GLUT3灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖

2.3兩組胎盤(pán)組織GLUT3 mRNA的表達(dá) FGR組胎盤(pán)組織母體面GLUT3 mRNA的表達(dá)水平(2.12±0.23)明顯高于對(duì)照組(0.46±0.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FGR組胎盤(pán)組織胎兒面GLUT3 mRNA的表達(dá)水平(0.55±0.18)與對(duì)照組(0.51±0.14)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4兩組胎盤(pán)組織GLUT3蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組比較，F(xiàn)GR組胎盤(pán)組織母體面GLUT3蛋白的表達(dá)(1.12±0.23)明顯高于對(duì)照組(0.48±0.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FGR組胎盤(pán)組織胎兒面GLUT3蛋白(0.55±0.09)與對(duì)照組(0.51±0.15)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

3 討 論

FGR在我國(guó)發(fā)病率為3%～7%，是一種嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥，圍產(chǎn)兒的病死率是正常胎兒的4～6倍，其新生兒遠(yuǎn)期和近期并發(fā)癥均明顯升高[7]。葡萄糖是胎兒和胎盤(pán)主要的能量來(lái)源，是維持胎兒正常的代謝和生長(zhǎng)的必需物質(zhì)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受到復(fù)雜的機(jī)制調(diào)控。葡萄糖通過(guò)胎盤(pán)組織從母體轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)，而胎盤(pán)本身也會(huì)消耗葡萄糖[8]，當(dāng)胎盤(pán)處于缺氧狀態(tài)時(shí)會(huì)過(guò)度消耗葡萄糖。胎兒組織攝取葡萄糖受葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控。GLUT3的分布有組織特異性，主要表達(dá)在代謝活躍的組織中如胎盤(pán)、大腦、視網(wǎng)膜的神經(jīng)元。GLUT3對(duì)葡萄糖具有較低的Km,當(dāng)?shù)孜锏幕钚越档蜁r(shí)GLUT3仍然可以保持活性。隨著妊娠增加，GLUT3在胎盤(pán)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中起著更重要的作用，影響胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的植入、分化[9]，參與妊娠早期和妊娠晚期胚胎發(fā)育的調(diào)控[10-11]，在妊娠晚期GLUT3逐漸代替GLUT1，隨著妊娠進(jìn)展GLUT3在胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖方面起著更重要的作用。FGR時(shí)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體隨胎兒血糖濃度急性或慢性改變而出現(xiàn)相應(yīng)的增加或降低。當(dāng)胎盤(pán)中GLUT表達(dá)異常時(shí)，葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)或利用受損，使胎兒葡萄糖攝取不足，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)FGR胎盤(pán)的GLUT3表達(dá)出現(xiàn)明顯改變。

本研究顯示，GLUT3主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，部分表達(dá)于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞。這與許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)妊娠早期GLUT3在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)相一致[12]。GLUT3在FGR胎盤(pán)組織母體面表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，F(xiàn)GR胎盤(pán)組織母體面GLUT3 mRNA和蛋白明顯高于對(duì)照組，兩組間胎盤(pán)組織胎兒面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上研究結(jié)果表明，F(xiàn)GR胎盤(pán)的母體面和胎兒面對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同。既往研究表明從足月胎盤(pán)分離培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)GLUT3 mRNA表達(dá)增加[11]。來(lái)源于絨毛膜癌的滋養(yǎng)葉細(xì)胞隨著供氧壓力降低，GLUT3表達(dá)呈劑量依賴(lài)性增高，同時(shí)伴隨著上皮細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)增加[13]。因?yàn)镕GR的胎盤(pán)絨毛血管發(fā)育異常，胎盤(pán)血流處于低灌注狀態(tài)，使胎盤(pán)絨毛間氣體交換下降，胎盤(pán)處于缺氧狀態(tài)，故推測(cè)因?yàn)镕GR胎盤(pán)處在缺氧狀態(tài)導(dǎo)致胎盤(pán)組織母體面GLUT3表達(dá)增加，從而提高了葡萄糖從母體到胎盤(pán)的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加胎盤(pán)組織內(nèi)葡萄糖以提供更多能量來(lái)適應(yīng)胎盤(pán)缺氧狀態(tài)，但胎盤(pán)因缺氧過(guò)度消耗葡萄糖，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的葡萄糖減少，從而FGR。另一方面，F(xiàn)GR胎盤(pán)組織母體面GLUT3表達(dá)增加可能與糖皮質(zhì)激素增高有關(guān)系[14]。FGR發(fā)生時(shí)胎兒處于高水平的糖皮質(zhì)激素環(huán)境中，胎盤(pán)組織母體面GLUT3表達(dá)增高是提高胎盤(pán)對(duì)葡萄糖的供應(yīng)，以減輕胎兒暴露于糖皮質(zhì)激素引起的胎兒低血糖[15]，但是胎盤(pán)過(guò)度消耗葡萄糖損害了葡萄糖向胎兒轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)受限。

FGR嚴(yán)重程度與胎盤(pán)缺氧受損程度密切相關(guān)。FGR胎盤(pán)組織母體面GLUT3表達(dá)增高提示胎盤(pán)發(fā)生缺氧程度。胎盤(pán)因缺氧而過(guò)度消耗了葡萄糖，最終可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒的葡萄糖降低，影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。