趙信平,徐龍權(quán),宋建國(guó),魚(yú)紅閃

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

人參屬(五加科)植物囊括了許多重要的藥用植物,包括最廣為人知的人參、三七、西洋參等,迄今為止已發(fā)現(xiàn)有12種[1],具有悠久的使用歷史[2]。人參皂苷是人參屬植物中的的重要活性物質(zhì)[3],目前已分離鑒定出182種[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷具有提高免疫、抗腫瘤、降血糖等多種生物活性作用[5-10]。人參皂苷是由糖和苷元相連而成的糖苷類化合物,按其苷元的結(jié)構(gòu)不同分為3類[11]:二醇型人參皂苷(PPD),如Rbl、Rb2、Rc、Rh2、Compand K等;三醇型人參皂苷(PPT),如Re、Rgl、Rf、Rh1等[12]以及齊墩果酸型人參皂苷。其中人參皂苷Rbl和Re在天然植物中含量較高,而Rh1、Rh2、Compand K等含量甚微。最新藥理學(xué)研究表明,有些稀有人參皂苷對(duì)于細(xì)胞凋亡的保護(hù)[13]、逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥性[14]、調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性[15]及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[16]等都具有很好的療效。如果以含量較高的人參皂苷為底物,利用生物轉(zhuǎn)化法大量制備稀有人參皂苷,具有廣泛的應(yīng)用前景[17]。

本論文研究的人參皂苷Rb3屬于四環(huán)三萜類二醇型皂苷,其C-20位末端上連有一個(gè)木糖基。人參皂苷Rb3在木糖苷酶的作用下,脫去木糖基,釋放出具有藥效活性的苷元部分,可以與其它抗癌化合物合成抗癌藥物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)木糖苷酶的研究日漸深入[18-22],Garciacampayo等[23]從Neocallimastixfrontalis中分離純化的β-D-木糖苷酶的最適pH和溫度分別為6.4、37 ℃;Dehnavi E[24]等首次將糖苷水解酶(GH)家族43β-木糖苷酶基因在畢赤酵母中的克隆和表達(dá),其重組蛋白的pH為4.8,最適溫度為50 ℃。雖然目前已從多種微生物中分離出木糖苷酶,但是將其應(yīng)用到天然木糖苷的生物轉(zhuǎn)化的報(bào)道卻很少。最近,實(shí)驗(yàn)室在霉菌中篩選到一株菌種Absidiasp.GRB3-X8r,此菌株發(fā)酵能產(chǎn)生木糖苷酶水解人參皂苷Rb3木糖基。本文通過(guò)對(duì)Absidiasp.GRB3-X8菌產(chǎn)的粗酶液進(jìn)行分離純化,得到能專一性水解人參皂苷Rb3木糖基的木糖苷酶,并對(duì)該酶的理化性質(zhì)進(jìn)行了深入研究,同時(shí)對(duì)該酶的催化特性進(jìn)行了初步測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Absidiasp.GRB3-X8r(犁頭霉) 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏所提供;人參皂苷Rb3、Rd、F2、C-K 實(shí)驗(yàn)室自制,HPLC純度達(dá)到95%以上;實(shí)驗(yàn)所用人參皂苷Rb3、Rd 實(shí)驗(yàn)室自制,HPLC純度達(dá)到80%以上;人參粉 北京同仁堂大連分店;麥芽汁 實(shí)驗(yàn)室自制;透析袋 上海新睿生物科技有限公司;硫酸銨、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、檸檬酸、冰醋酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

DEAE-Cellulose DE52 What man公司;Silica Gel 60-F254薄層層析板 德國(guó)Merck公司;CS930雙波長(zhǎng)薄層掃描儀 日本津島公司;BSZ-160自動(dòng)部分收集器 上海金生達(dá)生化儀器有限公司;蛋白質(zhì)電泳儀 Bio-Rad公司;GL-ZLM高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙市湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制方法 斜面培養(yǎng)基:采用察氏培養(yǎng)基,此培養(yǎng)基的配方為:NaNO30.3 g,KCl 0.05 g,KHPO40.1 g,FeSO40.001 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,蔗糖3 g,瓊脂2 g,去離子水100 mL。將菌種接種此培養(yǎng)基上,恒溫培養(yǎng)箱中29～30 ℃培養(yǎng)6～7 d。放置于4 ℃保藏待用。

人參浸出液的制備:稱取人參粉100 g倒入燒杯,并在燒杯中加入600 mL水,溫火加熱,熬煮7 h,熬煮過(guò)程中補(bǔ)水100 mL;用紗布過(guò)濾,濾液于8000 r/min下離心10 min;得上清人參浸出液,補(bǔ)水至300 mL備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:取12 mL的人參浸出液加入48 mL的麥芽汁,再加入40 mL水補(bǔ)齊至100 mL(液體發(fā)酵培養(yǎng)基的麥芽汁糖度是5o,pH為6.8),制成人參皂苷Rb3木糖基水解酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 粗酶液的制備 根據(jù)李明華等[25]研究的霉菌液體菌種的方法培養(yǎng)菌種,然后用移液槍取5 mL菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,將接種了Absidiasp.GRB3-X8r菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫振蕩器內(nèi),在29 ℃,160 r/min條件下培養(yǎng)4～5 d。將發(fā)酵培養(yǎng)好的100 mL發(fā)酵液,用高速冷凍離心機(jī)在8000 r/min下離心15 min,去除菌體,收集上清液;在磁力攪拌條件下,緩慢加入已研磨好的硫酸銨粉末至80%飽和度;于4 ℃下靜置4 h。再用高速冷凍離心機(jī)在13000 r/min下離心20 min,棄上清,收集蛋白質(zhì)沉淀。沉淀用10 mL 20 mmol/L pH3.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液溶解,然后裝入透析袋,用相同緩沖液透析24 h,約每2 h更換一次緩沖液。透析結(jié)束后,用高速冷凍離心機(jī)在13000 r/min下離心10 min,除去不溶性雜蛋白。所得上清液即為粗酶液。

1.2.3 酶的分離純化 采用DEAE-Cellulose DE52陰離子交換柱對(duì)粗酶液進(jìn)行分離純化,向平衡好的離子交換柱中加入6 mL粗酶液,粗酶液上柱后依次采用由磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(20 mmol/L pH3.0)配制的濃度為40、50、60、70、80、90 mmol/L的KCl溶液進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗100 mL,控制流速為1 mL/min,每3 mL收集1試管。

1.2.4 薄層層析(TLC) 人參皂苷木糖苷酶水解人參皂苷Rb3生成人參皂苷Rd的酶反應(yīng)檢測(cè)TLC 條件是:展開(kāi)劑為V(正丁醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=4∶1∶2,噴10% H2SO4水溶液后,在105 ℃加熱5 min顯色。通過(guò)軟件Bandscan分析TLC板上各個(gè)斑點(diǎn)的含量,從而來(lái)確定產(chǎn)物的含量,計(jì)算酶活力。

1.2.5 蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的測(cè)定 采用SDS-PAGE電泳法來(lái)測(cè)定人參皂苷Rb3木糖苷酶的純度及其分子量[26-27]。其中濃縮膠為5%,分離膠為12%,電壓分別為60 V和120 V。

1.2.6 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 采用Folin-酚法[28]測(cè)定酶液中的蛋白含量,以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 人參皂苷Rb3木糖基水解酶的酶性質(zhì)研究

酶的最適pH:用不同pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的緩沖溶液配制人參皂苷Rb3溶液。取50 μL純化酶液與不同pH、濃度為0.2%人參皂苷Rb3底物溶液等比例混合,分別測(cè)酶活力,以最高酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活力,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次,以pH為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

酶的pH穩(wěn)定性:取50 μL純化酶液與50 μL不同pH的緩沖液等量混合,室溫下放置30 min,然后加入100 μL濃度為0.2%人參皂苷Rb3底物溶液,然后分別測(cè)酶活力,以未經(jīng)處理過(guò)的酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活力,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次,以pH為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

酶的最適溫度:50 μL純化酶液與50 μL濃度為0.2%人參皂苷Rb3底物溶液等比例混合,分別在25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下反應(yīng),分別測(cè)定酶活力,以最高酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活力,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次,以溫度為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

酶的溫度穩(wěn)定性:50 μL純化酶液分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃下30 min迅速冷卻到室溫,加入等量的濃度為0.2%人參皂苷Rb3底物溶液,分別測(cè)酶活力,以未經(jīng)保溫處理過(guò)的酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活力,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次,以溫度為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

金屬離子對(duì)酶活力的影響:分別配制成含有2、5、25、50、100、200 mmol的KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H20、Cacl2、Pb(C2H3O2)2·3H2O、NiSO4·6H20、MnSO4·H20、EDTA的酶反應(yīng)溶液,在pH3.0,溫度為40 ℃下反應(yīng)12 h,測(cè)定酶活力,確定這些金屬離子對(duì)人參皂苷Rb3木糖苷酶活性的影響。

1.2.8 酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax及Km測(cè)定 按照1.2.4酶活力的測(cè)定方法,測(cè)定在不同濃度的人參皂苷Rb3底物溶液下的酶活力,以酶反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo),底物濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo),繪制Lineweaver-Burk圖,計(jì)算酶動(dòng)力常數(shù)Vmax及Km。

1.2.9 以Rb3為底物的酶活力的測(cè)定 人參皂苷Rb3木糖苷酶活力測(cè)定方法:取4 mg人參皂苷Rb3溶于1 mL 20 mmol/L pH3.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中,配制成人參皂苷Rb3底物溶液。取上述人參皂苷Rb3底物溶液50 μL,加入50 μL酶液混合,于40 ℃下反應(yīng)24 h,然后加入200 μL水飽和正丁醇終止酶反應(yīng),振蕩,分層,取上層液作薄層層析檢測(cè),并進(jìn)行定量分析計(jì)算[29]。酶活力定義為:在上述條件下,每小時(shí)生成1 μmol人參皂苷Rd的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.10 以pNP為底物的酶活性測(cè)定 以對(duì)硝基苯酚單糖苷(pNP-α-D-Gal,pNP-β-D-Gal,pNP-β-L-Ara,pNP-α-L-Rha,pNP-β-D-Xyl,pNP-α-D-Glu,pNP-β-D-Glu)為底物,反應(yīng)體系250 μL,其中含有200 μL的0.08 mmol/L的pNP底物溶液,酶樣品50 μL,40 ℃反應(yīng)30 min后加入2.5 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng),測(cè)定405 nm下的吸光值。酶活力定義為:單位時(shí)間內(nèi)釋放1 μmol硝基苯酚的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗酶液的純化

將微生物發(fā)酵后制備的粗酶液,經(jīng)80%飽和度硫酸銨沉淀后,用DEAE-Cellulose DE52離子交換柱層析純化,采用自動(dòng)部分收集器對(duì)洗脫液進(jìn)行收集,在280 nm紫外光下測(cè)定蛋白的吸光值,對(duì)洗脫曲線的出峰管進(jìn)行酶活力測(cè)定,TLC顯示有酶活力部分見(jiàn)圖1,其對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。TLC結(jié)果表明,67、68、69、70、71管中的提純酶液與人參皂苷Rb3作用后,底物人參皂苷Rb3已被完全水解,出現(xiàn)了一條新的人參皂苷Rd條帶,說(shuō)明人參皂苷Rb3的木糖基被水解,從而轉(zhuǎn)化生成了人參皂苷Rd。圖2的SDS-PAGE電泳圖中,第69管中的純化酶出現(xiàn)單一的蛋白條帶,說(shuō)明酶蛋白得到了很好的純化。

圖1 出峰管酶活力測(cè)定結(jié)果Fig.1 Results of the enzyme activity of the peak tube were determined by TLC注:Rd,Rb3:人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品;數(shù)字表示出峰管號(hào); S表示反應(yīng)所用人參皂苷Rb3底物。

圖2 酶蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE diagram of purified enzyme protein

經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀以及DEAE-Cellulose DE52分離純化的結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可以看出純化后酶蛋白的含量為0.227 mg/mL,純化倍數(shù)為13.33,回收率為9.02%。

表1 人參皂苷Rb3木糖苷酶純化結(jié)果Table 1 Results of purification of ginsenoside Rb3 xylosidase

根據(jù)SDS-PAGE得到其相對(duì)分子量約為66.7 kDa。

2.2 人參皂苷Rb3木糖苷酶最適反應(yīng)pH及其pH穩(wěn)定性

圖3最適反應(yīng)pH表明,人參皂苷Rb3木糖苷酶在pH3.0 時(shí)酶活力最好,在接近中性環(huán)境下酶活力下降的較快,如該酶在pH5.0時(shí)相對(duì)酶活力為77.8%,而在pH6.0時(shí)相對(duì)酶活力為51.8%,pH大于9時(shí),酶活力基本喪失,所以該酶在堿性環(huán)境下酶活力不高。由圖3 pH穩(wěn)定性可知,在pH2.2～6范圍內(nèi),酶活力保持在80%以上,說(shuō)明該酶在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較高;在pH6～8.0范圍內(nèi),酶活力保持在60%以上,說(shuō)明該酶液在pH2.2～8范圍內(nèi)酶活力保持穩(wěn)定。因此為了保持其酶活力,最好讓該酶在酸性條件下保存。

圖3 人參皂苷Rb3木糖苷酶最適反應(yīng)pH及其pH穩(wěn)定性Fig.3 Optimal reaction pH value and stability of the pH value of ginsenoside Rb3 xylosidase

2.3 人參皂苷Rb3木糖苷酶最適反應(yīng)溫度及其溫度穩(wěn)定性

圖4最適反應(yīng)溫度表明,人參皂苷Rb3木糖苷酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃,超過(guò)40 ℃后酶活性隨著溫度的升高而下降。50 ℃時(shí)相對(duì)酶活力為61.8%,而55 ℃時(shí)為45.6%。由圖4溫度穩(wěn)定性可知,酶液在20～60 ℃保持30 min后,殘余酶活力保持在80%以上,而當(dāng)酶液在70 ℃以上保持30 min后,酶活力迅速下降至酶活力喪失,說(shuō)明該酶在20～60 ℃范圍內(nèi)酶活力相對(duì)穩(wěn)定。因此保存該酶時(shí),溫度不能超過(guò)60 ℃。

圖4 人參皂苷Rb3木糖苷酶最適反應(yīng)溫度及其溫度穩(wěn)定性Fig.4 Optimal reaction temperature and stability of temperature of the ginsenoside Rb3 xylosidase

2.4 金屬離子對(duì)人參皂苷Rb3木糖苷酶酶活力的影響

由表2可知,EDTA對(duì)照組中各濃度對(duì)酶活力無(wú)影響,K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+離子對(duì)人參皂苷Rb3木糖苷酶無(wú)明顯作用。Zn2+、Pb2+、Ni2+金屬離子對(duì)人參皂苷Rb3木糖苷酶有一定的抑制作用,特別是Pb2+、Ni2+的濃度大于100 mmol/L,Zn2+的濃度大于200 mmol/L時(shí),對(duì)酶活力的影響較大,相對(duì)酶活力低于60%。

表2 金屬離子對(duì)人參皂苷Rb3木糖苷酶酶活力的影響Table 2 Effect of metal ions on ginsenoside Rb3 xylosidase activity

2.5 人參皂苷Rb3木糖苷酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax及Km

在pH3.0、40 ℃條件下,以不同濃度的人參皂苷Rb3為反應(yīng)底物,測(cè)定其與酶液的反應(yīng)速率,采用Lineweaver-Burk法得到反應(yīng)速率倒數(shù)與底物濃度倒數(shù)的關(guān)系曲線圖(圖5),計(jì)算得到該酶的Km值為65.63 mmol/L,Vmax為2.03 mmol/(h·L)。

圖5 人參皂苷Rb3木糖苷酶的雙倒數(shù)圖Fig.5 Lineweaver-Burk plot of ginsenoside Rb3 xylosidase

2.6 以人參皂苷Rb3為底物的酶催化特性

采用1.2.2方法,對(duì)Absidiasp.GRB3-X8r菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)并提取粗酶液,共制備粗酶液50 mL。利用1.2.4和1.2.9方法,對(duì)粗酶液進(jìn)行酶活力的測(cè)定,結(jié)果如圖6所示。從圖6(a)中可以看出人參皂苷Rb3完全被粗酶液水解,生成的產(chǎn)物主要是F2和C-K,沒(méi)有檢出人參皂苷Rd?？赡苁侨藚⒃碥誖b3經(jīng)粗酶液中的木糖苷酶水解掉C-20位末端上的木糖基生成人參皂苷Rd后,再經(jīng)過(guò)其他人參皂苷酶[30]水解生成人參皂苷F2和C-K。為了驗(yàn)證以上的推測(cè),以人參皂苷Rd為底物,用粗酶液進(jìn)行了相同的酶反應(yīng),同時(shí)采用2.1中純化得到的酶液以人參皂苷Rb3為底物進(jìn)行酶反應(yīng),結(jié)果如圖6(b)和圖6(c)所示。圖6(b)表明,人參皂苷Rd在粗酶液的作用下水解生成人參皂苷F2和C-K,圖6(c)表明,純化酶只能水解人參皂苷Rb3上的木糖基生成人參皂苷Rd。由此可以斷定,微生物發(fā)酵后提取的粗酶液中,除了含有能水解人參皂苷Rb3上C-20位末端木糖基的酶外,還含有能水解其他糖苷鍵的人參皂苷酶。利用該粗酶液,就可將人參皂苷Rb3徹底水解,轉(zhuǎn)化成F2和C-K。微生物產(chǎn)粗酶液水解人參皂苷Rb3的酶反應(yīng)過(guò)程如圖7所示。

圖6 酶活力測(cè)定TLC圖Fig.6 Results of enzyme activity were determined by TLC

圖7 人參皂苷Rb3轉(zhuǎn)化C-K過(guò)程Fig.7 Process of Rb3 transform to C-K

2.7 以pNP單糖苷為底物酶催化特性

用純化后的第69管酶液,采用1.2.10方法,進(jìn)行酶活力測(cè)定,結(jié)果如表3所示。表中數(shù)據(jù)表明,該酶不僅能水解β-D-木糖苷,還能水解β-D-半乳糖苷和β-D-葡萄糖苷,對(duì)α-D-半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷、α-L-鼠李糖苷、β-L-阿拉伯糖苷無(wú)水解能力,表現(xiàn)出獨(dú)特的水解特性。

表3 木糖苷酶水解不同糖苷化合物的底物特異性Table 3 Substrate specificity of xylosidase to various glycosidases

3 結(jié)論

本文首次報(bào)道了來(lái)源于Absidia屬微生物的木糖苷酶,對(duì)該酶純化后表明,它能夠高效水解人參皂苷Rb3上C-20位末端的木糖基,蛋白比活力達(dá)160 U/mg,明顯高于其他一些來(lái)源于真菌的木糖苷酶。對(duì)該酶的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),其最適反應(yīng)pH為3.0,在pH2.2～pH8.0范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,這一點(diǎn)與已報(bào)道最適pH為中性或弱堿性的木糖苷酶有很大的不同。該酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃,在20～60 ℃范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。金屬離子K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+離子對(duì)人參皂苷Rb3木糖苷酶無(wú)明顯作用,Zn2+、Pb2+、Ni2+對(duì)人參皂苷Rb3木糖苷酶有抑制作用,并且隨著濃度的增大,抑制作用越明顯。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,該酶的分子量為66.7 kDa;反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究表明Km值為65.63 mmol/L,Vmax為2.03 mmol/(h·L)。對(duì)酶的催化特性的研究發(fā)現(xiàn)利用該菌產(chǎn)粗酶液,就可對(duì)三七莖葉中含量豐富的人參皂苷Rb3進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,進(jìn)而生成F2和C-K,為今后有效利用三七莖葉皂苷及其在健康產(chǎn)品及醫(yī)藥方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。