李凌慧,魏 月,呂 佼,楊舒妍,馬晶軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院,河北滄州 061100)

棉酚是一種淡黃色的化合物,主要存在于棉花植物的根、莖、葉和種子內(nèi),植株的不同部位所含棉酚含量為0.04%～1.3%[1],棉籽仁中棉酚含量最高,大約為0.3～20 g/kg[2-3]。自然界中,棉酚主要以游離棉酚和結(jié)合棉酚形式存在[4],游離棉酚具有一定毒性,結(jié)合棉酚是游離棉酚與氨基酸、小肽等分子結(jié)合后形成的不具毒性的衍生化合物[5],通常不會(huì)對(duì)人體健康造成危害,生成的棉酚衍生物還具有改善糖尿病、抗生育、抗氧化活性、抗腫瘤及作為抗腫瘤藥物、抗癌等醫(yī)用價(jià)值[6-10]。棉籽粕作為質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的動(dòng)物飼料蛋白源之一[11-12],被畜禽大量攝入時(shí),其中含有的游離棉酚會(huì)使畜禽出現(xiàn)食欲減退,呼吸困難,受精率下降等癥狀[13],并通過(guò)食物鏈的作用,蓄積在肉、蛋、奶等食物中,間接威脅人類健康。例如,雛鴨的飼料中游離棉酚含量達(dá)到320 mg/kg就會(huì)導(dǎo)致棉酚在雛鴨體內(nèi)蓄積,損傷肝臟并且破壞代謝系統(tǒng)的正常運(yùn)行[14]。2013年10月臺(tái)灣大統(tǒng)長(zhǎng)基食品公司被查出造假“黑心油”事件,其中粗制棉籽油高達(dá)5828.62 t,長(zhǎng)期食用這種油的人就會(huì)出現(xiàn)棉酚中毒的癥狀[15]。

外國(guó)學(xué)者在檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中棉酚是否存在及其含量方面的研究較少,大多都研究棉酚及其衍生物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,這可能與中西方飲食文化差異有關(guān)。隨著我國(guó)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中棉酚危害認(rèn)識(shí)不斷加深,先后提出并修訂了GB 13078-2017[16]和GB 2716-2005[17]兩個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)棉酚的技術(shù)也在不斷發(fā)展,本文主要概述電化學(xué)分析技術(shù)、光譜分析技術(shù)、色譜分析技術(shù)和分子印跡技術(shù)的定量分析方法在農(nóng)產(chǎn)品中棉酚含量檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展,為后期農(nóng)產(chǎn)品中棉酚的定量分析研究提供一定的參考。

1 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析是儀器分析的重要組成部分之一。電化學(xué)分析法是根據(jù)物質(zhì)在溶液中的電導(dǎo)、電勢(shì)等電化學(xué)性質(zhì)而建立的一類分析方法,電化學(xué)分析具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、測(cè)量范圍寬、操作方便等優(yōu)點(diǎn),便于與自動(dòng)化技術(shù)聯(lián)用容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,易于微型化,適于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量,在食品質(zhì)量安全檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用[18-20]。

1.1 極譜法

極譜法通過(guò)測(cè)定電解過(guò)程中所得到的極化電極的電流-電位(或電位-時(shí)間)曲線來(lái)確定溶液中被測(cè)物質(zhì)濃度的一類電化學(xué)分析方法。極譜法是使用滴汞電極或其他表面能夠周期性更新的液體電極為極化電極,分為控制電位極譜法和控制電流極譜法兩大類。1922年,捷克化學(xué)家J.海洛夫斯基建立了極譜法[21],早在1984年,姜永等[22]介紹了極譜法測(cè)定棉酚的方法,通過(guò)改進(jìn)測(cè)定條件,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度更高。極譜法可用來(lái)測(cè)定大多數(shù)金屬離子、陰離子(如F-、Cl-、I-)和有機(jī)化合物,在生物化學(xué)方面也有廣泛的應(yīng)用,具有適用范圍廣、精確度高、靈敏度高的特點(diǎn)[23],但極譜法使用汞電極會(huì)產(chǎn)生汞蒸氣,危害人體健康,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意通風(fēng),所以此方法很少用于棉酚的定量分析。

1.2 庫(kù)侖法

庫(kù)侖分析法是以測(cè)量電解過(guò)程中被測(cè)物質(zhì)在電極上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)所消耗的電量來(lái)進(jìn)行定量分析的一種電化學(xué)分析法,分為控制電位庫(kù)侖分析法和恒電流庫(kù)侖滴定法。1985年,姜永等[24]建立了TLC—溴庫(kù)侖法測(cè)定棉籽中棉酚的方法,結(jié)果表明庫(kù)侖法可以消除棉酚類似物的干擾,可用于棉酚樣品及其制劑的測(cè)定。但是庫(kù)侖分析法具有一定局限性,必須保證電極反應(yīng)專一,電流效率100%才可以使用此方法。以上兩種電化學(xué)分析法因具有各自的局限性,目前不再被用于棉酚的檢測(cè),但隨著電子技術(shù)的發(fā)展,這可能為研究出新型電子檢測(cè)技術(shù)提供依據(jù)。

2 光譜分析法

光譜分析方法是基于物質(zhì)與輻射作用時(shí),測(cè)量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生的能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長(zhǎng)和強(qiáng)度,以此來(lái)鑒別物質(zhì)及確定它的化學(xué)組成和相對(duì)含量的方法[25],光譜法分為吸收光譜法和發(fā)射光譜法兩類。定量研究棉酚在農(nóng)產(chǎn)品中的含量大多采用原子吸收法、近紅外光譜分析法和紫外可見分光光度法。

2.1 原子吸收法

原子吸收光譜法是具有待測(cè)元素特征波長(zhǎng)的光通過(guò)試樣原子蒸氣時(shí),被測(cè)元素的基態(tài)原子所吸收,然后利用光被吸收的程度來(lái)測(cè)定被測(cè)元素含量的方法。原子吸收法更適合于定量分析,它是利用待測(cè)元素所產(chǎn)生的基態(tài)原子對(duì)其特征譜線的吸收程度來(lái)進(jìn)行定量分析的,原子吸收法靈敏度高、精密度高、選擇性好、干擾少并且應(yīng)用范圍廣。董仕林等[26]應(yīng)用原子吸收法測(cè)定棉籽油中游離棉酚,方法的檢出限為100 μg/kg,平均回收率為99.8%,儀器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～6.8%。這種方法檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中棉酚,精確度不高,穩(wěn)定性相對(duì)較差,難以檢測(cè)痕量棉酚,且儀器占地面積大、消耗材料貴。

2.2 近紅外光譜法

近紅外光譜分析技術(shù)被譽(yù)為化學(xué)分析領(lǐng)域的“巨人”,現(xiàn)如今發(fā)展迅速,在光譜分析技術(shù)中占有很重要的地位[27],通過(guò)掃描樣品的近紅外光譜,可以得到樣品中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息,而且利用近紅外光譜技術(shù)分析樣品具有方便、快速、高效、準(zhǔn)確和成本較低,不破壞樣品,不消耗化學(xué)試劑,不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。Cheng Li等[28]使用近紅外光譜聯(lián)合蒙特卡羅無(wú)信息變量消除法與非線性多元校正相的方法聯(lián)合可以快速、準(zhǔn)確的定量分析棉籽中棉酚含量,預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為0.0422,決定系數(shù)(R2)為0.9331,殘差預(yù)測(cè)偏差(RPD)為3.8374。由于棉酚在近紅外區(qū)的吸收系數(shù)小,因此,紅外光譜法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中的痕量棉酚進(jìn)行定量分析應(yīng)用較少。

2.3 紫外可見分光光度法

紫外—可見分光光度計(jì)可以對(duì)物質(zhì)的組成、含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、測(cè)定和推斷,應(yīng)用廣泛,不僅可以進(jìn)行定量分析,還可以利用吸收峰的特性進(jìn)行定性分析和簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)分析,靈敏度高、準(zhǔn)確度高、選擇性好、操作方便、分析速度快、應(yīng)用范圍廣。1988年,張紹衡等[29]建立了紫外分光光度計(jì)測(cè)定棉籽油中的游離棉酚的方法,此方法的檢出限為5000 μg/kg。這種方法雖然操作簡(jiǎn)單,但樣品處理復(fù)雜,易受雜質(zhì)干擾,棉籽油樣品易乳化,使檢測(cè)值偏高。田秀蕓等[30]在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了前處理方法,用Mg(NO3)2作為破乳劑以消除乳化現(xiàn)象,分析的準(zhǔn)確度與精密度均符合定量分析的要求。2017年,Daminato B等[31]建立了一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)棉籽粕中棉酚含量的方法,基于流動(dòng)注射分析系統(tǒng),在660 nm下進(jìn)行分光光度檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了對(duì)棉籽粕固體樣品的直接分析。紫外分光光度法對(duì)樣品純度要求高,待測(cè)樣品中含有雜質(zhì)或檢測(cè)基質(zhì)復(fù)雜的樣品時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大的偏差,靈敏度不高。

3 色譜分析法

色譜分析法是利用物質(zhì)的物理性質(zhì)進(jìn)行分離和分析的檢測(cè)方法,被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、材料、食品等各個(gè)科學(xué)領(lǐng)域,用于多組分復(fù)雜混合物的分離分析,具有速度快、效率高、選擇性高和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。用于檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中棉酚含量的色譜分析法主要有高效薄層色譜法、高效液相色譜法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法三種。

3.1 高效薄層色譜法

高效薄層色譜法與普通薄層色譜法相比具有分辨效率高、分析時(shí)間短和檢出靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),因操作簡(jiǎn)單方便被應(yīng)用于許多物質(zhì)的檢測(cè)。沈靜等[32]用高效薄層色譜法測(cè)定棉籽油中游離棉酚含量,結(jié)果表明棉酚對(duì)照品溶液在8～128 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,平均回收率為91.5%～100.2%。結(jié)果表明薄層掃描法測(cè)定棉籽油中游離棉酚含量,方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、可行。此方法具有使用方便、快速、再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但是對(duì)生物高分子分離效果不好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠但精確度不高,難以實(shí)現(xiàn)痕量棉酚的檢測(cè)。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,液相色譜分離系統(tǒng)由固定相和流動(dòng)相組成。HPLC具有高選擇性、靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一。李東雨等[33]HPLC內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)牛乳中游離棉酚的方法,以甘草次酸為內(nèi)標(biāo)物,檢出限為4 μg/kg,RSD小于2%,平均加標(biāo)回收率為102.3%～103.0%,該實(shí)驗(yàn)對(duì)烏魯木齊市各散裝牛乳點(diǎn)樣品進(jìn)行檢測(cè),未檢出游離棉酚。宣巖芳等[34]用HPLC法檢測(cè)雞蛋中游離棉酚和總棉酚的含量,在0.1～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,加標(biāo)回收率為89.6%～91.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10%～4.06%(n=6),檢出限為200 μg/kg,定量限為500 μg/kg。Karishma R等[35]使用HPLC對(duì)不同棉花品種棉籽中棉酚含量進(jìn)行測(cè)定,并成功檢測(cè)出棉籽中游離棉酚和總棉酚的含量。姚軍等[36]建立了家兔血漿中棉酚的HPLC測(cè)定方法,平均加標(biāo)回收率為95.7%～96.3%,檢出限為200 μg/kg,采用丙酮-乙腈-正庚烷-磷酸鹽溶液提取家兔血漿中游離棉酚,為生物體內(nèi)棉酚的測(cè)定提供了可靠的分析方法。雖然HPLC的分析成本較高,但是它可以通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相的組成實(shí)現(xiàn)多組分分析物的分離,并實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量棉酚的檢測(cè),儀器的靈敏度、精密度均高于高效薄層色譜法。

3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

以超高效液相色譜(UPLC)、高效液相色譜(HPLC)或液相色譜(LC)作為分離系統(tǒng),串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)作為檢測(cè)系統(tǒng)的液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)利用色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力,與質(zhì)譜或光學(xué)儀器的高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn),將分離技術(shù)與目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合的方式成功地應(yīng)用于痕量棉酚的定性、定量分析工作中。Zhang W[37]等用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜HPLC-MS/MS外標(biāo)法定量檢測(cè)食用油中棉酚含量,定量限為100 μg/kg,加標(biāo)回收率為87.4%～100%,穩(wěn)定性高,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%～12.2%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,穩(wěn)定性好。袁潔等[38]等用LC-MS/MS法測(cè)雞肝中棉酚旋光異構(gòu)體,線性范圍為0.1603～8.015 μg/mL,檢出限為1.2 μg/kg,回收率在80.1%～115.0%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%,驗(yàn)證了此方法的高靈敏度和精密度。施琦貽[39]建立了HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)檢測(cè)鮮蛋黃中的棉酚殘留,線性范圍為1～100 ng/mL,加標(biāo)回收率在85%～100%之間,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)小于10%,精密度相對(duì)較好。姚軍等[40]建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS)檢測(cè)棉籽仁中左旋和右旋棉酚含量的方法,以(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇為手性拆分試劑進(jìn)行柱前衍生化反應(yīng),左旋和右旋棉酚的檢出限分別為2.52、3.41 μg/kg,平均加標(biāo)回收率為99.4%～103.0%。LC-MS/MS檢測(cè)方法具有靈敏度高,分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn),但是儀器價(jià)格和日常維護(hù)費(fèi)用昂貴,分析成本較高,限制了此方法檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中棉酚含量的推廣使用。

3.4 高效毛細(xì)管電泳法

高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)是依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離分析的液相分離方法。郭玉娟等[41]建立了高效毛細(xì)管電泳法檢測(cè)棉籽油中游離棉酚含量的方法,線性范圍為10～100 μg/mL,平均回收率為99.4%～100.2%,精密度RSD為1.2%,檢出限為1000 μg/kg。該方法精密度較好、檢出限低、準(zhǔn)確度高,適用于棉籽油中游離棉酚含量的檢測(cè)。

4 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)作為一種新的分析檢測(cè)技術(shù),可以滿足快速檢測(cè)的要求,且靈敏性高、成本低,具有預(yù)定性、特異識(shí)別性和廣泛實(shí)用性的特點(diǎn)。2014年,趙晨等[42]設(shè)計(jì)了具有PMAA/SiO2結(jié)構(gòu)的表面分子印跡聚合物來(lái)檢測(cè)棉酚,使用色譜分析的方法對(duì)制備的印PMAA/SiO2跡聚合物的容量因子進(jìn)行了檢測(cè),并與高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測(cè)器(HPLC-UV)的容量因子進(jìn)行了比較,得出MIP-PMAA/SiO2對(duì)棉酚檢測(cè)的效果要優(yōu)于HPLC-UV。為了減小棉酚的檢測(cè)周期,降低檢測(cè)成本,Chen Z等[3]提出了一種新型壓電分子印跡傳感器,對(duì)棉酚和其相似物進(jìn)行檢測(cè),最低檢測(cè)限6 μg/kg,結(jié)果表明壓電型分子印跡傳感器具有的特異性和靈敏性。分子印跡技術(shù)檢測(cè)成本低,檢出限低,使用壓電型分子印跡傳感器是極具潛力的測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中棉酚含量的方法。

5 結(jié)論與展望

綜上所述,本文從電化學(xué)分析技術(shù)、光譜分析技術(shù)、色譜技術(shù)、分子印跡技術(shù)等方面闡述了定量分析農(nóng)產(chǎn)品中棉酚含量的檢測(cè)技術(shù)及特點(diǎn),并對(duì)部分檢測(cè)方法的檢出限進(jìn)行比較,見表1。由表1可知,高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的檢出限相對(duì)較低,檢測(cè)樣品的樣品基質(zhì)不同也可能對(duì)結(jié)果有一定影響,高效液相色譜和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢出限低、精密度高,聯(lián)合分子印跡技術(shù)的壓電型分子印跡傳感器檢測(cè)棉酚的成本低較。上世紀(jì)80年代有人嘗試使用電化學(xué)分析法檢測(cè)棉酚,這種方法的檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)在先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果相比并不理想,但目前電子技術(shù)發(fā)展迅速,這可能為研究出用于檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中棉酚的最佳電子技術(shù)提供參考。

表1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)棉酚的檢出限Table 1 Detection limit of gossypol by different detection methods

農(nóng)產(chǎn)品中棉酚的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展較快,應(yīng)根據(jù)農(nóng)產(chǎn)品樣品的本質(zhì)屬性與實(shí)驗(yàn)條件,選擇較為合適的檢測(cè)方法對(duì)毒性棉酚進(jìn)行提取與測(cè)定。未來(lái)可以將新型前處理技術(shù)應(yīng)用到復(fù)雜基質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品的樣品中,例如石墨烯吸附法、QuEChERS提取法、懸浮固化微萃取等低填料、低溶劑量的前處理方法等,并結(jié)合快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù),以實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量棉酚的檢測(cè)。近年來(lái),隨著科技的進(jìn)步與創(chuàng)新,農(nóng)產(chǎn)品中棉酚的檢測(cè)技術(shù)也在不斷更新,試劑盒也已成為快速檢驗(yàn)化合物的生物學(xué)方法,為棉酚的快速檢測(cè)方法提供了新方向。因此,建立更加準(zhǔn)確、高效、綠色的分析方法仍然是農(nóng)產(chǎn)品中棉酚含量檢測(cè)領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)。