樊佳歡,葉 穎,毛偉杰

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品高值化加工與利用團(tuán)隊(duì),廣東湛江 524088)

章魚又名八爪魚,廣泛分布于淺水中,其肉嫩味美,營養(yǎng)豐富,是一種典型的海洋生物。2016年,我國章魚年捕撈量達(dá)13.7萬t[1]。章魚在加工過程中除其腕部、軀干肉質(zhì)被加以利用外,會(huì)產(chǎn)生大約50%的下腳料,其中包括內(nèi)臟、皮、眼窩、脖子等,大部分被廢棄[2],造成極大的污染與浪費(fèi)。而且,這部分下腳料中含有多糖、?；撬?、脂肪酸等多種生物活性物質(zhì),有很高的利用價(jià)值[3]。章魚下腳料還含有豐富的風(fēng)味物質(zhì),適合用于生產(chǎn)海鮮調(diào)味料。近年來，關(guān)于章魚內(nèi)臟的研究主要集中在其有效活性成分提取或酶解工藝優(yōu)化方面[2-8],但是蛋白質(zhì)酶解物普遍存在苦腥味較重的問題,關(guān)于章魚內(nèi)臟酶解液的脫腥問題還需要進(jìn)一步探討。本文首先探討章魚內(nèi)臟的酶解條件,然后采用掩蔽法即通過添加胡椒粉、姜蒜粉等香辛料來掩蓋酶解液苦腥味,探討添加物的種類和添加量對調(diào)味料口感的影響。以期為充分利用章魚內(nèi)臟、減輕環(huán)境污染、開發(fā)新型海鮮調(diào)味料提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

中國水章魚內(nèi)臟 購于湛江市東洋水產(chǎn)公司,1 h內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室,取出章魚內(nèi)臟后貯藏于-70 ℃冰箱;加碘精鹽 廣東省鹽業(yè)集團(tuán)有限公司;純正白砂糖 太古糖業(yè)有限公司;姜蒜粉 上海味好美食品有限公司;胡椒粉 汕頭市熊記食品有限公司;食用(玉米)淀粉 佛山市順德區(qū)金鼎盛調(diào)味食品有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 廣東光華化學(xué)廠有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BXH-65電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;HANGPING FA2004電子天平 上海天平儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠;PB-10 普及型pH計(jì) 德國Sartorius公司;XW-80A漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;UV-3200PC分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;90-1離心機(jī) 上海手術(shù)器械廠;DL-5-B低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;NE-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廣州托普儀器有限公司;HHS恒溫水浴鍋、SX2-4-10馬弗爐 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;722S分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 章魚內(nèi)臟基本成分的測定 水分:直接干燥法,參照GB/T 5009.3-2016;脂肪:索氏提取法,參照GB/T 5009.6-2016;蛋白質(zhì):凱氏定氮法,參照GB/T 5009.5-2016;灰分:550 ℃灼燒法,參照GB/T 5009.4-2016;氨基酸態(tài)氮:甲醛電位滴定法,參照GB/T 5009.235-2016。

1.2.2 工藝流程 章魚內(nèi)臟→清洗→打漿→加酶→調(diào)節(jié)pH→恒溫酶解→滅酶→4000 r/min,離心10 min(上清液)濃縮→調(diào)味→濃縮→干燥→成品。

1.2.3 酶解液的制備 取章魚內(nèi)臟常溫解凍后清洗,按一定料水比打出勻漿,加入胰蛋白酶搖勻,用1% NaOH或1%鹽酸調(diào)pH至一定值,放置一定溫度的振蕩器中,酶解一定時(shí)間后取出,60 ℃下滅酶20 min,冷卻后以4000 r/min離心20 min得澄清透明酶解液。

1.2.4 影響章魚內(nèi)臟酶解效果的單因素實(shí)驗(yàn) 據(jù)商家提供數(shù)據(jù),胰蛋白酶在酶液濃度為0.25%,pH為7.0、溫度為37.0 ℃時(shí),胰蛋白酶酶溶液的作用能力最強(qiáng)。取章魚內(nèi)臟勻漿在參考1.2.3數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行以下單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.1 胰蛋白酶的作用濃度 固定反應(yīng)條件為酶解時(shí)間為6.0 h、底物溶度為20.0%、酶解pH為7.0、酶解溫度為60 ℃,參考文獻(xiàn)[4,9-11]先選取0.5%濃度的胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),研究結(jié)果表示以1.0%為間隔增大時(shí),結(jié)果變化明顯,故調(diào)整了1.0%為間隔。所以探討不同胰蛋白酶的作用濃度(E/S)(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%)對章魚內(nèi)臟的水解度的影響。

1.2.4.2 時(shí)間 固定反應(yīng)條件為胰蛋白酶的作用濃度2.0%、底物溶度為20.0%、酶解pH為7.0、酶解溫度為60 ℃,參考文獻(xiàn)[4,12-13]探討不同酶解章魚內(nèi)臟的時(shí)間(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 h)對章魚內(nèi)臟的水解度的影響。

1.2.4.3 底物濃度 固定反應(yīng)條件為酶解時(shí)間為8.0 h、胰蛋白酶的作用濃度2.0%、酶解pH為7.0、酶解溫度為60.0 ℃,參考文獻(xiàn)[10,14]先選取5.0%濃度的胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),研究結(jié)果表示以5.0%為間隔增大時(shí),結(jié)果變化不明顯,故選取了10.0%為間隔。所以探討不同酶解底物濃度(5.0%、10.0%、20.0%、30.0%、40.0%)對章魚內(nèi)臟的水解度的影響。

1.2.4.4 酶解溫度 固定反應(yīng)條件為底物溶度為10.0%、胰蛋白酶的作用濃度2.0%、酶解pH為7.0、酶解時(shí)間為8.0 h,參考文獻(xiàn)[4,10,15]探討不同酶解章魚內(nèi)臟的溫度(30、40、50、60、70 ℃)對章魚內(nèi)臟的水解度的影響。

1.2.4.5 酶解pH 固定反應(yīng)條件為酶解溫度為40 ℃、胰蛋白酶的作用濃度2.0%、底物濃度為10%、酶解時(shí)間為8.0 h,參考文獻(xiàn)[10,15-16]探討不同胰蛋白酶水解的pH條件(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)對章魚內(nèi)臟的水解度的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取酶的作用濃度(E/S)、酶解底物濃度、酶解溫度這三個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal experiment

1.2.6 水解度的計(jì)算 參照GB/T 5009.235-2016測定出氨基酸態(tài)氮，參照GB/T 5009.5-2016測定出總氮,兩者相除得出水解度,計(jì)算公式如下:

1.2.7 胰蛋白酶的酶活測定及計(jì)算 采用紫外分光光度法測定酶的活性，首先配制濃度為100 ug/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用紫外分光光度計(jì)于275 nm測定其吸光度(A)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量(μg)，即為吸光常數(shù)K值(其K值應(yīng)在130～135范圍內(nèi)),計(jì)算公式如下：

式中:X-樣品的酶活力,U/mL;A-試樣溶液的平均吸光度,nm;K-吸光常數(shù);8-反應(yīng)試劑的總體積8.00 mL;2-吸取酶液2.00 mL;1/10-反應(yīng)時(shí)間10 min,以1 min計(jì);n-稀釋倍數(shù);E-紫外法與福林法的換算系數(shù)(中性、堿性蛋白酶系數(shù)為0.50;酸性蛋白酶系數(shù)為0.77)。

注:在40 ℃下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸,定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.2.8 海鮮調(diào)味料的調(diào)配 根據(jù)海鮮調(diào)味料的呈味特點(diǎn)及調(diào)味原理[15,17-19],選取最佳酶解條件作用后的15%海鮮風(fēng)味基料與鹽、糖、胡椒粉及姜蒜粉(生姜粉和大蒜粉以1∶2比例混合)進(jìn)行調(diào)味,并以表2作為評價(jià)指標(biāo),通過8名食品專業(yè)人員對試樣進(jìn)行打分,分值為1～7分(從極端不好到極端好),對4種調(diào)味料的最佳工藝條件進(jìn)行探索,添加量以不同水平符號(hào)為代表(見表3)。最后以最佳的鹽、糖、胡椒粉和姜蒜粉添加量來調(diào)味章魚內(nèi)臟海鮮風(fēng)味基料,并加入玉米淀粉為填充劑,經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空濃縮(0.08 MPa,溫度80～90 ℃)和噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度180～190 ℃,出風(fēng)溫度 80～90 ℃)后，制成味道鮮美、營養(yǎng)豐富的章魚內(nèi)臟海鮮調(diào)味料。

表2 “滋味”特性評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory of “taste” evaluation standards

表3 調(diào)味品添加量與水平代表Table 3 Additions of condiments and level representations

1.2.9 調(diào)味料理化及衛(wèi)生指標(biāo)測定 水分:直接干燥法,參照GB/T 5009.3-2016;總砷含量:砷斑法,參照GB/T 5009.11-2014;鉛含量:二硫腙比色法,參照GB/T 5009.12-2017;菌落總數(shù):平板計(jì)數(shù)法,參照GB4789.2-2016;大腸菌群:MPN法,參照GB4789.3-2016。

1.2.10 海鮮調(diào)味料的風(fēng)味分析 將章魚內(nèi)臟海鮮調(diào)味料利用輕松感官分析系統(tǒng)軟件,將感官評分進(jìn)行風(fēng)味剖面檢驗(yàn),分等級為1～7分[20]。

1.2.11 調(diào)味料的感官評價(jià)方法 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10485-2008 《海鮮粉調(diào)味料》,分別就“色澤”、“形態(tài)”、“香氣”與“滋味”四種特性，對表3中的四個(gè)因素不同濃度鹽(5%、15%、25%、35%、45%、55%)、糖(2%、6%、10%、14%、18%、22%)、胡椒粉(1%、2%、3%、4%、5%、6%)和姜蒜粉(1%、2%、3%、4%、5%、6%)來進(jìn)行感官評定,各特性的最高分值的規(guī)定見表4?！白涛丁碧匦栽u分與其他三種特性不同,是把評價(jià)的強(qiáng)度結(jié)果用等距標(biāo)度計(jì)分,以七分制轉(zhuǎn)化為數(shù)值,其評定標(biāo)準(zhǔn)見表2,最后將感官得分進(jìn)行方差分析。在感官品評之前，首先對8名品評員進(jìn)行解說和培訓(xùn),評定時(shí)品評員先以康師傅鮮蝦魚板面的調(diào)味包作為參照物進(jìn)行評分,再對隨機(jī)編號(hào)后的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品進(jìn)行感官評定。

表4 基于SBT 10485-2008制定的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory evaluation criteria-based on SBT 10485-2008 standard

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 7.0和Microsoft Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)表示。方差分析方法參考[21]方差F值的計(jì)算方法,查F分布表,求F(df,dfE,α)。當(dāng)F>F(dfA,dfE,α),則在顯著水平α=0.05上有顯著差異,否則無顯著性差異。df為處理間的自由度,dfE為處理內(nèi)的自由度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力的測定

胰蛋白酶的酶活力為8396.8 U/g,在有效范圍內(nèi)。

2.2 章魚內(nèi)臟主要成分分析

軟體動(dòng)物蛋白質(zhì)含量一般為7%～23%[2],而由表5可見章魚內(nèi)臟中水分含量為73.8%±0.59%,蛋白質(zhì)含量僅次于水分,為14.3%±0.14%,所以酶解章魚內(nèi)臟對充分利用資源,開發(fā)新產(chǎn)品都有十分重要的意義。

表5 章魚內(nèi)臟的基本化學(xué)成分Table 5 Basic chemical composition of octopus viscera

2.3 酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酶濃度對酶解效果的影響 由圖1可以看出,水解度基本呈上升趨勢,這是因?yàn)槊赣昧吭蕉?更有利于底物的酶解。當(dāng)酶的作用濃度為0.5%～2.0%,其上升趨勢比較明顯,之后變化平穩(wěn),從經(jīng)濟(jì)方面考慮,選取2.0%為章魚內(nèi)臟最佳酶的作用濃度,此時(shí)水解度較高,高達(dá)34.0%。與文獻(xiàn)[22]中的研究結(jié)果一致:胰蛋白酶的水解度隨酶量的增加而增加。

圖1 酶濃度(E/S)對酶解效果的影響Fig.1 The effect of enzyme concentration on enzymolysis

2.3.2 酶解時(shí)間對酶解效果的影響 由圖2可以看出,隨著酶解時(shí)間的增加,水解度呈上升趨勢,這是因?yàn)?，酶作用于底物上時(shí)間越長,酶解的更加充分。當(dāng)酶解時(shí)間在8.0 h以后,底物幾乎消耗完畢,水解度基本不變,故選擇胰蛋白酶酶解章魚內(nèi)臟的最佳時(shí)間為8.0 h,此時(shí)水解度為36.0%。

圖2 酶解時(shí)間對酶解效果的影響Fig.2 The effect of time on enzymolysis

2.3.3 酶解的底物濃度對酶解效果的影響 由圖3可以看出,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%～10%之間時(shí),隨著酶解底物濃度的增加,水解度呈明顯上升趨勢,當(dāng)大于10%時(shí),水解度逐漸下降。底物濃度的大小對酶解效果的影響比較明顯,濃度太大和太小都不利于水解反應(yīng)的進(jìn)行[23],故選取胰蛋白酶酶解章魚內(nèi)臟的最佳底物濃度為10.0%。

圖3 酶解底物濃度對酶解效果的影響Fig.3 The effect of the substrate concentration on enzymolysis

2.3.4 酶解溫度對酶解效果的影響 由圖4可以看出,當(dāng)溫度為30.0～40.0 ℃之間時(shí),隨著溫度的升高,水解度明顯增大,在溫度達(dá)到40.0 ℃以后,水解度呈下降趨勢。這是因?yàn)?，酶是熱敏物質(zhì),當(dāng)達(dá)到最適溫度后會(huì)失活變性,酶解效果降低,故酶解章魚的最佳溫度條件為40.0 ℃,此時(shí)水解度為40.0%。

圖4 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.4 The effect of temperature on enzymolysis

2.3.5 酶解pH對酶解效果的影響 由圖5可以看出,當(dāng)酶解pH在5.0～8.0之間時(shí),隨著酶解pH的升高,水解度一直上升,當(dāng)酶解pH大于8時(shí),酶解pH開始下降,這是因?yàn)?，酶具有最適pH,當(dāng)超過此值會(huì)失活變性，導(dǎo)致酶解效果下降,故酶解章魚內(nèi)臟的最佳pH為8.0,此時(shí)水解度為37.5%。pH影響酶的穩(wěn)定性,改變pH大小,會(huì)影響蛋白酶分子的空間構(gòu)象、與催化有關(guān)基團(tuán)的解離狀況、酶分子及底物的結(jié)合狀態(tài)及酶-底物復(fù)合物的解離,從而影響酶解反應(yīng)[24]。

圖5 酶解pH對酶解效果的影響Fig.5 The effect of pH on enzymolysis

2.4 酶解條件的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6,根據(jù)極差值Rj得出,A(底物濃度)>A×C(酶的作用濃度)>空白>B(溫度)>B×C>C>A×B,所以只考慮前三個(gè)主要因素。雖然A因素對章魚內(nèi)臟水解度的影響最大,但A×C因素的影響大于C因素,所以只需要分析因素A×C的相互搭配,其搭配實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可知,因素A、C之間的最好搭配是A2C2。對于B因素,通過Kij和kij值看出其最佳水平為B3。故本試驗(yàn)應(yīng)選取的最優(yōu)水平組合為A2B3C2,即本實(shí)驗(yàn)的最佳底物濃度為10.0%、最佳酶作用濃度(E/S)為2.5%、最佳酶解時(shí)間為40.0 ℃。

表6 章魚內(nèi)臟酶解條件正交設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Orthogonal design and the results of conditions of enzymatic hydrolysis on octopus viscera

表7 A×C搭配表Table 7 A×C cross-linkTable

2.5 海鮮調(diào)味料調(diào)味實(shí)驗(yàn)

對4種因素所得的感官評分進(jìn)行表8的方差分析,已知對于4種因素中的6組不同濃度樣品的自由度dfA為5,對于8名品評員自由度dfB則為7;處理內(nèi)的自由度dfE為35。故F(dfA,dfE,α)為2.48,F(dfA,dfB,α)為2.28。由表8可得,當(dāng)顯著水平α=0.05時(shí),除了鹽和糖這兩個(gè)添加量,品評員之間無顯著差異(p>0.05)。這可能是因?yàn)辂}與糖是日常常用的調(diào)味品,品評員對其味道比較習(xí)慣。其他因素都有顯著性差異(p<0.05),說明各實(shí)驗(yàn)因素相互獨(dú)立,實(shí)驗(yàn)誤差較小,可提供一定的參考作用。其平均感官得分結(jié)果如圖6,由圖6可知，當(dāng)鹽濃度為35%(水平為3)、糖濃度為14%(水平為3)、胡椒粉濃度為3%(水平為2)和姜蒜粉濃度為4%(水平為3)時(shí),產(chǎn)品比較容易被大多數(shù)人接受。

表8 方差分析Table 8 Variance analysis

圖6 不同調(diào)味品添加量對章魚內(nèi)臟 海鮮調(diào)味料感官得分的影響Fig.6 Effects of different condiments on sensory scores of octopus viscera seafood seasoning

2.6 海鮮調(diào)味料的風(fēng)味分析

根據(jù)風(fēng)味剖面檢驗(yàn)報(bào)告結(jié)果(見表9)及其QDA(圖7)可看出,海鮮調(diào)味料綜合印象較好,咸味、鮮味強(qiáng)烈。以市面上類似的產(chǎn)品康師傅鮮蝦魚板面調(diào)味包與本海鮮調(diào)味料所做的感官評價(jià)如表10對比可知,章魚內(nèi)臟海鮮調(diào)味料比康師傅鮮蝦魚板面調(diào)味包評分更高,產(chǎn)品具有海鮮調(diào)味料特有的色澤、香氣和滋味。其水分含量為1.0%±0.78%,砷含量為(0.15±0.02) mg/kg,鉛含量為(0.3±0.04) mg/kg,細(xì)菌總數(shù)<8000 CFU/g,大腸菌群<100 MPN/100 g,微生物指標(biāo)和理化指標(biāo)均達(dá)到SB/T 10485-2008 《海鮮粉調(diào)味料》所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。所以本產(chǎn)品安全又美味,與市場上主流產(chǎn)品媲美,可推廣到市面上。

表9 章魚內(nèi)臟海鮮調(diào)味料的風(fēng)味剖面檢驗(yàn)報(bào)告Table 9 Octopus viscera seafood seasoning flavor profile inspection reports

表10 章魚內(nèi)臟海鮮調(diào)味料與康師傅鮮蝦魚板面調(diào)味包的感官得分對比Table 10 Comparison of sensory scores between octopus viscera seafood seasoning and Master Kang shrimp-fish seasoning

圖7 章魚內(nèi)臟海鮮調(diào)味料的QDA圖Fig.7 QDAFigure of octopus viscera seafood seasoning

3 結(jié)論

本文利用章魚內(nèi)臟加工海鮮調(diào)味料,利用胰蛋白酶對其水解,探討了酶解最佳工藝條件、酶解液的最佳調(diào)味條件，并分析了各最佳條件下生產(chǎn)的海鮮調(diào)味料的風(fēng)味特性,主要結(jié)論如下:

結(jié)合單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可得出胰蛋白酶酶解章魚內(nèi)臟的最佳酶解條件為:底物濃度為10.0%、酶作用濃度(E/S)為2.5%、酶解溫度為40 ℃、酶解時(shí)間為8.0 h、酶解pH為8.0。

在海鮮調(diào)味料調(diào)味方面,通過單因素實(shí)驗(yàn)及方差分析確定最佳的調(diào)味料的用量為:食鹽35%、蔗糖14%、胡椒粉3%、姜蒜粉4%,制作出海鮮調(diào)味料無明顯苦味和腥味,具有較強(qiáng)烈的海鮮風(fēng)味,本研究不僅大大提高了章魚下腳料的產(chǎn)品附加值,而且減少了環(huán)境污染,得到的章魚內(nèi)臟海鮮調(diào)味料具有營養(yǎng)、美味與安全等特點(diǎn),具有一定的市場前景。但是在研究中還有很多的不足,蛋白水解酶較為單一,水解率較低,在后續(xù)研究中可添加復(fù)合酶以提高水解率。