杜麗東 雒軍 吳國泰 牛亭惠 李越峰 袁菊麗 任遠(yuǎn)

摘要：目的 觀察當(dāng)歸對血虛便秘模型小鼠結(jié)腸水通道蛋白8（AQP8）的表達(dá)及AC-cAMP-PKA信號通路各因子含量的影響，探討當(dāng)歸潤腸通便作用機(jī)制。方法 60只KM小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組和當(dāng)歸高、中、低劑量組，每組10只。采用復(fù)方地芬諾酯、乙酰苯肼及環(huán)磷酰胺聯(lián)合復(fù)制血虛便秘小鼠模型，實(shí)驗(yàn)第14日起，當(dāng)歸高、中、低劑量組分別給予16.7、8.8、4.2 g原藥材/kg當(dāng)歸水煎液灌胃，陽性藥組給予5.0 g/kg常通舒顆粒藥液灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，觀察小鼠血虛便秘證候、排便時(shí)間，免疫組化、Western blot和qRT-PCR檢測小鼠結(jié)腸AQP8蛋白和mRNA的表達(dá)，ELISA檢測小鼠結(jié)腸AC-cAMP-PKA信號通路中各因子的表達(dá)。結(jié)果 模型組小鼠出現(xiàn)血虛便秘證候，糞便排出時(shí)間較正常組明顯延長（P<0.01），結(jié)腸AQP8蛋白和mRNA表達(dá)及腺苷酸環(huán)化酶（AC）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，當(dāng)歸各劑量組小鼠糞便排出時(shí)間明顯縮短，結(jié)腸AQP8蛋白和mRNA表達(dá)及AC、cAMP、PKA含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 當(dāng)歸治療血虛便秘可能與調(diào)節(jié)結(jié)腸AC-cAMP-PKA信號通路，下調(diào)結(jié)腸AQP8蛋白和mRNA的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；血虛便秘；水通道蛋白8；AC-cAMP-PKA；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.011

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0044-05

Abstract： Objective To observe the effects of Angelica Sinensis Radix on the expression of aquaporin 8 （AQP8） and the levels of AC-cAMP-PKA in colon of blood-deficiency constipation in mice； To identify mechanism of Angelica Sinensis Radix for loosening the bowels to relieve constipation. Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into control group， model group， positive medicine group， and Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups， with ten mice in each group. Diphenoxylate， acetylphenlyhydrazine and cyclophosphamide were used to establish blood-deficiency constipation mice models. From the 14th day of the experiment， Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups were given 16.7， 8.8， and 4.2 g/kg Angelica Sinensis Radix Decoction for gavage. Positive medicine group was given 5.0 g/kg Changtongshu Granules Liquid for gavage. Control group and model group were given equal volume of saline for gavage. The symptoms of blood deficiency constipation were observed and defecation time. Immunohistochemistry， Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression of AQP8 protein and mRNA in colon， and the expression of AC-cAMP-PKA in colon was detected by ELISA. Results The mice in the model group developed blood deficiency constipation syndrome； the defecation time was significantly prolonged （P<0.01）； the expression level of colonic AQP8 protein and mRNA， AC， cAMP and PKA significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， the defecation time was significantly shortened in Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups； the expression of AQP8 protein and mRNA and the levels of AC， cAMP and PKA were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The treatment of Angelica Sinensis Radix for blood-deficiency constipation may be related to adjusting the AC-cAMP-PKA signaling pathways and reducing the expression of AQP8 protein and mRNA.

Keywords： Angelica Sinensis Radix； blood-deficiency constipation； aquaporin 8； AC-cAMP-PKA； mice

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelicae sinensis （Oliv.）Diels的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效。古醫(yī)籍記載以當(dāng)歸配伍治療血虛便秘，如《沈氏尊生書》“潤腸丸”，《脾胃論》“導(dǎo)滯通幽湯”；當(dāng)代名中醫(yī)亦喜用當(dāng)歸配伍治療血虛便秘，如李國峰自擬養(yǎng)血潤腸方[1]，張東岳的“秘寶康”[2]等。以上方劑均以當(dāng)歸組方治療血虛便秘療效較好，但當(dāng)歸潤腸通便的藥理機(jī)制尚不十分明確。有研究表明，結(jié)腸黏膜水通道蛋白（AQP）8在糞便的水分吸收、黏液的分泌中發(fā)揮重要作用[3]。有研究表明，AQPs C末端磷酸化對其活性有調(diào)節(jié)作用，文獻(xiàn)證實(shí)AC-cAMP-PKA途徑參與了AQPs的表達(dá)調(diào)控[4]。本研究采用復(fù)方地芬諾酯、乙酰苯肼及環(huán)磷酰胺復(fù)制血虛便秘小鼠模型，觀察當(dāng)歸對血虛便秘模型小鼠結(jié)腸AQP8的表達(dá)及AC-cAMP-PKA信號通路各因子含量的影響，探討當(dāng)歸潤腸通便作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級KM小鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫22～26 ℃，相對濕度60%，自然晝夜光線，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥物及制備

當(dāng)歸，蘭州復(fù)興厚藥材有限公司，批號160502，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)劉峰林副教授鑒定為正品。稱取當(dāng)歸飲片，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，過濾，藥渣加6倍量水煎煮1 h，合并2次濾液，過濾，濃縮至1.7 g原藥材/mL，消毒后分瓶、壓蓋包裝，冰箱保存?zhèn)溆谩?fù)方地芬諾酯片，常州康普藥業(yè)有限公司，批號160502；乙酰苯肼，上海源葉生物科技有限公司，批號20150701258；環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號14081021；常通舒顆粒，貴州威門藥業(yè)股份有限公司，批號160101。

1.3 主要試劑與儀器

GAPDH抗體，美國ImmunoWay公司，批號B4501；SP檢測試劑盒、DBA顯色試劑盒，北京中杉金橋生物科技有限公司，批號16183A09、K162418A；Trizol Reagent，美國Invitrogen公司，批號108303；Nuclease-Free water，上海前塵生物科技有限公司，批號0000124196；Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司，批號04102；GoTaq? qPCR Master Mix，普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，批號0000161385；R0010 RIPA組織裂解液、PMSF、10×麗春紅染色液、BCA蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、甘氨酸、SDS、Tris，北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20161111、20161108、20161027、20161104、20161024、20161115、1203P0614、1207G033、2016S075；山羊抗兔二抗，美國ImmunoWay公司，批號B0101。Benchmark? Plus酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；BX51-32H01型顯微鏡，日本Olympus公司；低溫高速離心機(jī)，美國Biofage fresc公司；vortexer振蕩渦旋混合器，德國IKA公司；1008E型掌上離心機(jī)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；SMA2000Thermo超微量分光光度計(jì)，Thermo Fisher Scientific；Bio-rad iCycleriQ熒光定量PCR儀，美國伯樂公司；ELITE300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，美國Wealtec公司；AzureC300曝光儀，美國Azure Biosystems公司。

1.4 分組及造模

實(shí)驗(yàn)小鼠按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組和當(dāng)歸高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組小鼠第1、4、7、10日皮下注射乙酰苯肼60 mg/kg，第10～14日腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，并予復(fù)方地芬諾酯混懸液25 mg/kg灌胃（5 d為1個(gè)給藥周期，期間停藥2 d，共4個(gè)周期）。

1.5 給藥

實(shí)驗(yàn)第14日起，陽性藥組給予常通舒顆粒溶液5 g/kg（相當(dāng)于臨床60 kg體質(zhì)量成人日用量的5倍）灌胃，當(dāng)歸高、中、低劑量組給予當(dāng)歸水煎液16.7、8.3、4.2 g/kg（分別相當(dāng)于臨床60 kg體質(zhì)量成人日用量的20、10、5倍）灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積10 mL/kg，連續(xù)14 d。實(shí)驗(yàn)第28日，頸椎脫臼處死小鼠，迅速開腹取出結(jié)腸，分離系膜，取近端結(jié)腸約1 cm（距盲腸2 cm處），4%多聚甲醛固定，免疫組化檢測結(jié)腸AQP8蛋白表達(dá)；取近端結(jié)腸約3 cm（距盲腸3 cm處），沿縱軸剖開，冷生理鹽水沖洗后縱向均分，-80 ℃冰箱保存，用于AQP8蛋白和mRNA的檢測；取結(jié)腸約1 cm（距盲腸6 cm處），用于結(jié)腸腺苷酸環(huán)化酶（AC）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）檢測。

1.6 血虛便秘體征檢測

實(shí)驗(yàn)期間觀察記錄各組小鼠活動(dòng)狀態(tài)，毛色，口、鼻、唇、尾顏色及排便情況。

1.7 糞便排出時(shí)間測定

第27日，小鼠禁食不禁水12 h，每只小鼠給予5%炭末0.5 mL灌胃，單籠飼養(yǎng)并記錄小鼠首粒黑便排出時(shí)間。

1.8 免疫組化檢測結(jié)腸水通道蛋白8蛋白表達(dá)

采用經(jīng)典SABC法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行免疫組化染色。400倍光鏡下觀察結(jié)腸AQP8的表達(dá)部位并攝片，用ImageJ圖像處理軟件，每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，求平均光密度（AOD），計(jì)算AQP8的相對表達(dá)量。

1.9 RT-PCR檢測結(jié)腸水通道蛋白8 mRNA表達(dá)

采用Trizol法提取結(jié)腸總RNA，超微量分光光度計(jì)測定260 nm和280 nm吸光度，計(jì)算OD260/OD280和OD260/OD230，分析RNA的濃度和純度。嚴(yán)格按照Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒和GoTaq? qPCR Master Mix（A6001）試劑盒說明書，去除gDNA并合成cDNA，用RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃復(fù)性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算AQP8 mRNA的相對表達(dá)量。GAPDH引物序列：上游5'-CGTGCCT GGAGAAACCTG-3'，下游5-AGAGTGGGAGTTGA AGTCC-3'，擴(kuò)增長度242 bp。AQP8引物序列：上游5'-TGGCTGGCCTCTTTGTAGGA-3'，下游5'-GCTGT CATGGTGACTCCTGTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度200 bp。

1.10 Western blot測定結(jié)腸水通道蛋白8蛋白表達(dá)

用組織裂解液和PMSF提取結(jié)腸總蛋白，BCA法制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測各樣本蛋白濃度。以總蛋白∶上樣緩沖液=3∶1稀釋并變性。制備15%聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別與AQP8抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶3000）室溫孵育2 h后，4 ℃過夜，次日，HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，滴加適量ECL發(fā)光劑，凝膠成像儀手動(dòng)曝光15 s，采集圖像，用ImageJ軟件分析曝光后AQP8和GAPDH條帶的灰度值，計(jì)算AQP8蛋白相對表達(dá)量。

1.11 結(jié)腸腺苷酸環(huán)化酶、環(huán)磷酸腺苷、蛋白激酶A含量測定

按照結(jié)腸組織∶PBS=1∶9冰上勻漿，4 ℃、3000 r/min離心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸對模型小鼠體征的影響

正常組小鼠活潑好動(dòng)，被毛密而有光澤，糞便形狀規(guī)則，質(zhì)稍軟，互不粘連；模型組小鼠蜷縮，萎靡，被毛枯疏、易掉、光澤黯淡，耳、鼻、唇、尾蒼白，排便數(shù)量減少，糞便干結(jié)、粘連；當(dāng)歸高、中、低劑量組和陽性藥組小鼠上述血虛和便秘體征均有所好轉(zhuǎn)，反應(yīng)較為靈敏，毛色恢復(fù)光澤，糞便變軟，數(shù)量增多。

2.2 當(dāng)歸對模型小鼠首粒黑便排出時(shí)間的影響

與正常組比較，模型組小鼠首粒黑便排出時(shí)間顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，當(dāng)歸高、中、低劑量組和陽性藥組小鼠首粒黑便排出時(shí)間顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

2.3 當(dāng)歸對模型小鼠結(jié)腸水通道蛋白8蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色顯示，AQP8主要在小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞表達(dá)。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸AQP8表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，當(dāng)歸高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸AQP8表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖1、表2。

2.4 當(dāng)歸對模型小鼠結(jié)腸水通道蛋白8 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸AQP8 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，當(dāng)歸高、中、低劑量組和陽性藥組小鼠結(jié)腸AQP8 mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表3。

2.5 當(dāng)歸對模型小鼠結(jié)腸水通道蛋白8蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸AQP8蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，當(dāng)歸高、中劑量組小鼠結(jié)腸AQP8蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

2.6 當(dāng)歸對模型小鼠結(jié)腸AC-cAMP-PKA通路各因子含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸AC、cAMP和PKA含量均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸AC、cAMP和PKA含量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表5。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，血虛是因失血過多、脾胃虛弱、血液生化之源不足或瘀血阻滯導(dǎo)致的血液不足，和/或血的濡養(yǎng)功能減退的一種病理狀態(tài)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，貧血的成因包括紅細(xì)胞生成減少（骨髓造血功能障礙、造血物質(zhì)缺乏或利用障礙），紅細(xì)胞丟失或破壞過多（失血、溶血）等。有研究發(fā)現(xiàn)，血虛證癥狀在貧血患者中出現(xiàn)率較高，貧血的中醫(yī)證型以血虛證為主[2]。因此，實(shí)驗(yàn)研究常借鑒貧血的研究方法來研究和認(rèn)識(shí)血虛證。目前，便秘動(dòng)物模型復(fù)制和藥物干預(yù)的主要指標(biāo)為糞便排出時(shí)間。本研究采用乙酰苯肼+環(huán)磷酰胺+復(fù)方地芬諾酯聯(lián)合復(fù)制血虛便秘模型：利用乙酰苯肼緩慢氧化、破壞紅細(xì)胞膜；環(huán)磷酰胺引起骨髓抑制，使造血細(xì)胞生成減少，白細(xì)胞和粒細(xì)胞數(shù)量減少；復(fù)方地芬諾酯作用于腸壁阿片受體，降低腸道敏感性，提高平滑肌張力，使腸蠕動(dòng)減弱，腸內(nèi)容物滯留時(shí)間延長，水分重吸收增多，產(chǎn)生收斂止瀉作用。模型組小鼠首粒黑便排出時(shí)間顯著延長。當(dāng)歸各劑量組均能縮短糞便排出時(shí)間。

結(jié)腸黏膜表達(dá)的AQP8在糞便水分吸收、黏液分泌中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組化、RT-PCR和Western blot 3種方法檢測小鼠結(jié)腸AQP8蛋白和基因的表達(dá)，結(jié)果顯示當(dāng)歸各劑量組均可明顯降低模型小鼠結(jié)腸AQP8蛋白和基因的異常升高。與文獻(xiàn)報(bào)道便秘時(shí)結(jié)腸AQP8的表達(dá)一致[5]。

AC是廣泛分布在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的膜整合蛋白，能催化ATP生成cAMP并釋放出焦磷酸。cAMP是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)水液代謝和生理活動(dòng)的第二信使。PKA又稱為依賴cAMP的蛋白激酶A，PKA與cAMP結(jié)合后，能催化靶蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血虛便秘小鼠結(jié)腸中AC、cAMP和PKA均顯著升高，可能致使結(jié)腸AQPs的表達(dá)和活性增加，水分吸收增多而形成便秘。當(dāng)歸各劑量組均能顯著降低血虛便秘小鼠結(jié)腸AC、cAMP和PKA的含量，推測可能由于AC-cAMP-PKA途徑中各因子含量下降，AQPs的表達(dá)和活性減弱，水分重吸收減少，起到潤腸通便作用。

綜上所述，當(dāng)歸潤腸通便作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AC-cAMP-PKA信號通路，進(jìn)而影響結(jié)腸AQP8的表達(dá)，抑制近端結(jié)腸水分吸收、改善結(jié)腸潤滑功能有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李國峰.養(yǎng)血活血方治療血虛型便秘的臨床研究及對便秘模型小鼠結(jié)腸ICC的影響[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2008.

[2] 崔雷.秘寶康對便秘（血虛腸燥）模型小鼠腸道功能的影響[D].鄭州：河南中醫(yī)學(xué)院，2013.

[3] 智會(huì)，袁維堂.水通道蛋白3、4、8在大鼠慢傳輸便秘模型結(jié)腸粘膜中的表達(dá)[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2013.

[4] ITOH A， TSUJIKAWA T， FUJIYAMA Y， et al. Enhancement of aquaporin 3 by vasoactive intestinal polypeptide in a human colonic epithelial cell line[J]. Journal of Gastroenterology & Hepatology， 2010，18（2）：203-210.

[5] 錢海華，徐天舒，曾莉，等.通便顆粒調(diào)節(jié)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸水通道蛋白3和水通道蛋白8表達(dá)的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014， 20（24）：180-184.

（收稿日期：2017-11-16）

（修回日期：2017-12-08；編輯：華強(qiáng)）