董婷 楊文明 吳明彩 蔣懷周 黃鵬 匡春俊 張娟 韓輝

摘要：目的 觀察肝豆靈對高銅負荷小鼠神經(jīng)干細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平及核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2） mRNA及蛋白表達的影響。方法 體外培養(yǎng)高銅負荷小鼠神經(jīng)干細胞模型。實驗小鼠隨機分為空白對照組、模型組和肝豆靈低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)濃度肝豆靈藥物血清灌胃。采用MTT法檢測神經(jīng)干細胞增殖水平，流氏細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平，qRT-PCR檢測Nrf2基金表達，Western blot檢測細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達。結(jié)果 與空白對照組比較，模型組小鼠神經(jīng)干細胞增殖率顯著下降，ROS水平明顯升高，Nrf2基因、蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，肝豆靈各劑量組小鼠神經(jīng)干細胞增殖率顯著升高，ROS水平明顯降低，Nrf2基因、蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 肝豆靈通過降低高銅負荷小鼠ROS含量、上調(diào)Nrf2的表達，從而促進小鼠神經(jīng)干細胞的增殖。

關(guān)鍵詞：肝豆靈；高銅負荷；體外培養(yǎng)；神經(jīng)干細胞；活性氧；核因子E2相關(guān)因子2；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0053-04

Abstract： Objective To observe the effects of Gandouling on reactive oxygen species （ROS） level， the expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） mRNA and protein of neural stem cells of the mice cultured in high concentration copper. Methods The model of neural stem cells of the mice was cultured in vitro with high concentration copper. The experimental rats were randomly divided into blank control group， model group， and Gandouling low-， medium-， and high-dose groups. Each medication group was given relevant concentration of Gandouling serum for gavage. The MTT was adopted to test proliferation level on neural stem cells； flow cytometer was used to examine the change of ROS level in cells； qPCR was used to measure the expression of Nrf2 mRNA； Western blot was used to measure the change of the level of protein Nrf2 in cells. Results Compared with the blank control group， the proliferation rate of neural stem cells was significantly decreased， ROS levels were significantly increased， and Nrf2 gene and protein expression was significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， neural stem cells proliferation rate was significantly increased， ROS levels were significantly reduced， and Nrf2 gene and protein expression was significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Gandouling can promote the proliferation of neural stem cells in mice by reducing ROS content in high copper-loaded mice and up-regulating Nrf2 expression.

Keywords： Gandouling； high copper load； cultured in vitro； neural stem cells； reactive oxygen species； nuclear factor erythroid 2-related factor 2； mice

Wilson病是一種ATP7B基因缺陷所致的銅代謝障礙疾病，患者不能清除體內(nèi)多余的銅，導(dǎo)致銅在肝臟等組織中沉積，甚至可能引起嚴重的中樞損傷。銅是一種強氧化劑，它可以激活自由基的活性，進而促進細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，細胞內(nèi)銅過載，繼而誘發(fā)的氧化應(yīng)激，是大部分神經(jīng)變性疾病致病的共同特征與機理。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS從不同途徑損傷了各種大分子的生理功能，并攻擊特定腦組織區(qū)域的神經(jīng)細胞，導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡，直至疾病發(fā)生。而對此類疾病，降低ROS引起的損害是治療的關(guān)鍵，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2），作為一類對抗氧化應(yīng)激和保護細胞生存的轉(zhuǎn)錄因子，成為神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）損傷修復(fù)的潛在機制之一。在Wilson病研究過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞（NSC）是高銅負荷的重要靶點之一，NSC的增殖受損將嚴重影響腦部神經(jīng)細胞的再生能力，肝豆靈能抵抗高銅導(dǎo)致的NSC生長阻滯，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[1]。然而，作為肝豆靈重要靶點的NSC中發(fā)生分子變化機制不明，給精確解析肝豆靈的作用機理及開發(fā)新的藥物靶點造成障礙。因此，本實驗制備藥物血清，體外建立及高銅培養(yǎng)NSC，觀察肝豆靈對小鼠NSC的ROS和Nrf2的影響，探討其對高銅誘導(dǎo)的NSC損傷小鼠的保護作用及其分子機制。

1 實驗材料

1.1 動物

孕14 d ICR小鼠3只和SD大鼠40只（體質(zhì)量200～220 g），SPF級，安徽省動物中心提供，動物許可證號SCXK（皖）2014-002，孕14 d ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后取胚胎海馬組織，分離并培養(yǎng)NSC。SD大鼠于專用清潔實驗室飼養(yǎng)1周，溫度25 ℃，相對濕度50%～70%，模擬自然晝夜循環(huán)光照的非直射光線。

1.2 藥物

肝豆靈片，安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑（皖藥制字Z20050071），規(guī)格0.3 g/片，批號20150522。

1.3 主要試劑與儀器

胰蛋白酶、DMEM/F12（1∶1）液體培養(yǎng)基（HyClone公司），胎牛血清（Gibco公司），無血清培養(yǎng)添加劑N2（Gibco公司），重組人表皮生長因子（Peprotech公司），重組人堿性成纖維細胞生長因子（Peprotech公司），噻唑藍（Amresco公司），二甲基亞砜（Sigma公司），ROS檢測試劑盒（Thermo Scientific公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司），實時定量PCR試劑盒/SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Novoprotein公司），核蛋白提取試劑盒（Sigma公司），兔抗大鼠Nrf2單克隆抗體（Santa cruz公司），抗β-actin鼠克隆抗體（Santa cruz公司），抗大鼠Lamin B抗體（Santa cruz公司）。實時熒光定量PCR儀（美國AB公司），DU800紫外可見分光光度計（美國貝克曼公司），細胞培養(yǎng)箱2306-2（美國Shellab公司），倒置顯微鏡DMLL（德國徠卡），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。

2 實驗方法

2.1 肝豆靈藥物血清的獲取

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為空白對照組和肝豆靈藥物血清低、中、高劑量組（肝豆靈低、中、高劑量組）。給藥前大鼠禁食不禁水12 h，肝豆靈低、中、高劑量組分別給予0.48、0.96、1.92 g/（kg·d）肝豆靈藥物血清灌胃，空白對照組大鼠給予等量體積純凈水灌胃。給藥體積均為10 mL/（kg·d），連續(xù)3 d。于第4日灌胃給藥2 h后取血，3500 r/min離心15 min，分離血清，置于56 ℃水浴鍋滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，將肝豆靈各劑量組藥物血清配制成濃度為10%藥物血清培養(yǎng)液，低溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 神經(jīng)干細胞分離和培養(yǎng)

無菌條件下取孕14 d ICR小鼠胚胎海馬組織，經(jīng)胰蛋白酶解消化，轉(zhuǎn)入含0.7 mg/mL卵蛋白的DMEM/F12（1∶1）液中機械吹散。低溫2000 r/min離心細胞懸液5 min后洗滌沉淀，重懸細胞并調(diào)整活細胞濃度為5000～10 000/mL，進行懸浮培養(yǎng)。存活細胞以免疫細胞化學檢查，以驗證其均為Abcg2+的NSC。再將培養(yǎng)的NSC分為空白對照組、銅負荷模型組（模型組）和肝豆靈低、中、高劑量組?？瞻讓φ战M在DMEM中加入10%SD大鼠空白血清，模型組用含10%SD大鼠空白血清銅負荷培養(yǎng)基（200 μmol/L工作濃度[1]）培養(yǎng)；肝豆靈低、中、高劑量組分別用3種不同劑量配制的10%肝豆靈藥物血清銅負荷培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3 MTT實驗

分離培養(yǎng)的NSC接種于96孔培養(yǎng)板，細胞密度調(diào)整為1×104/孔，體積為100 ?L，每組設(shè)4個復(fù)孔，經(jīng)藥物血清培養(yǎng)后，加入MTT 20 ?L于37 ℃孵育4 h后收獲細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液。每孔沉淀加入二甲基亞砜150 ?L，溫和低速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，于酶標儀波長490 nm處測吸光度（A），計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=A值實驗組÷A值空白對照組×100%。

2.4 活性氧檢測

采用CellROXTM Deep Red Flow Cytometry Assay Kit分離、收集和流式分選Agcg2+的NSC。各組檢測用細胞濃度為5×105個/mL。將CellROX? Deep Red reagent（終濃度500～1000 nmol/L）加入樣本中，于37 ℃避光孵育30～60 min。在孵育的最后15 min內(nèi)，每1 mL樣本中加1 mmol/L SYTOX Blue Dead Cell Stain solution 1 μL，進行流式分析：于激發(fā)光波長405 nm處檢測SYTOX Blue Dead Cell Stain，于激發(fā)光波長635 nm處檢測Cell ROX Deep Red reagent，在450/50 BP和665/40 BP的濾光片處收集熒光發(fā)射光。

2.5 qRT-PCR檢測核因子E2相關(guān)因子2 mRNA表達

采用Trizol試劑提取各實驗組細胞總RNA，每組設(shè)3個復(fù)孔。采用DNaseⅠ（RNA free）去除RNA中殘存的DNA，檢測提取RNA含量及純度。RNA純度測定標準為：A260/A280>2.0。按試劑盒說明書以達到純度的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為25 ?L：RNA模板2 ?L，2×Access Quick? Master Mix 12.5 ?L，Nuclease-free water 6.5 ?L，AMV Reverse Transcriptase 0.5 ?L，引物各2 ?L。選擇基因β-actin為內(nèi)參照，進行qRT-PCR檢測。Nrf2上游：5'-GACCTAAAGCACAGC-3'，下游：5'-CTCAATCG GCTTGAATGTTTGTC-3'。β-actin上游：5'-CGCGAG AAGATACCCAGAT-3'，下游：5'-GCACTGTGTTGGC GTACAGG-3'，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，35個循環(huán)：95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5 min?；蛳鄬Ρ磉_量用2-ΔΔCt表示。

2.6 Western blot檢測核因子E2相關(guān)因子2蛋白表達

收集各實驗組細胞進行裂解，按試劑盒操作說明書于低溫條件下提取細胞核蛋白，測定蛋白濃度，取50 ?g蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；室溫低速振蕩封閉1 h后（封閉液采用5%脫脂奶粉），用TBST（含0.05% Tween-20的TBS緩沖液）溫和振蕩漂洗3次×15 min；加入兔抗大鼠Nrf2單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶200，4 ℃過夜，TBST洗膜3次后加入二抗（1∶500）室溫振蕩孵育3 h，讀膜采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，進行半定量分析處理。

3 統(tǒng)計學方法

采用SSPS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，各組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 肝豆靈藥物血清對體外高銅負荷小鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠NSC內(nèi)Nrf2細胞增殖率明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，肝豆靈各劑量組小鼠NSC細胞增殖率明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 肝豆靈藥物血清對體外高銅負荷小鼠神經(jīng)干細胞內(nèi)活性氧水平的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠NSC內(nèi)ROS明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，肝豆靈各劑量組小鼠NSC內(nèi)ROS水平明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 肝豆靈藥物血清對體外高銅負荷小鼠神經(jīng)干細胞內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2表達的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠NSC內(nèi)Nrf2 mRNA和蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，肝豆靈各劑量組小鼠NSC內(nèi)Nrf2 mRNA和蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表3。

5 討論

ROS是細胞發(fā)生凋亡的重要因素之一。NSC是一群能夠自我更新的細胞，在大腦發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；它們具有自我擴增和多系分化的特點，能夠補償?shù)蛲龌驂乃赖纳窠?jīng)細胞，從而抵抗微環(huán)境中的有害變化。研究表明，ROS過度產(chǎn)生可以引起干細胞功能減退，最終導(dǎo)致細胞靜止或細胞毒性[2]；另一方面，大量的ROS能夠驅(qū)動干細胞走出靜默狀態(tài)，逐漸導(dǎo)致干細胞庫的耗損[3]。在Wilson病中，多巴胺能神經(jīng)元對銅毒性更為脆弱，銅和多巴胺形成復(fù)合物并能夠?qū)е律窠?jīng)細胞凋亡。Nrf2是重要的氧化還原劑，在應(yīng)激的環(huán)境下，Nrf2就會被激活，且與多種抗氧化應(yīng)激基因結(jié)合，進而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。研究表明，Nrf2過表達能促進NSC增殖及向神經(jīng)元的分化，調(diào)控損傷的神經(jīng)再生過程，并保護NSC不受外來毒素的影響[4]。在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中發(fā)現(xiàn)，Nrf2信號通路均發(fā)揮重要作用[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NSC是高銅負荷的一個重要靶點，NSC增殖受損嚴重影響腦部神經(jīng)細胞的再生能力，降低ROS導(dǎo)致的損害[7]；并在高銅環(huán)境下，機體血液運行受到影響，痰濁、瘀血互相化生，痰瘀互結(jié)[8]。臨床研究顯示，肝豆靈能增加Wilson病患者尿銅和膽汁排銅，對清除肝臟、腎臟、腦部沉積銅有積極作用；可顯著改善患者神經(jīng)系統(tǒng)病變[9]；動物實驗研究表明，肝豆靈能夠抵抗高銅導(dǎo)致的海馬NSC生長阻滯，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[10]。肝豆靈片處方中石菖蒲、郁金為君藥，丹參、姜黃、莪術(shù)、雞血藤為臣藥，黃連、生大黃為佐藥，諸藥合用共奏化痰祛瘀、軟堅散結(jié)及排銅解毒的作用?，F(xiàn)代藥理研究顯示，石菖蒲、郁金可降低tau蛋白異常磷酸化水平、降低ROS損傷，提升抗氧化應(yīng)激能力，進而改善癡呆大鼠學習記憶能力[11]；丹參、莪術(shù)、姜黃的提取物隱丹參酮、莪術(shù)醇、姜黃素對前列腺癌干細胞的增殖有干預(yù)作用[12]；大黃、黃連可通過促進Nrf2的活化進而改善腎小管上皮細胞的氧化應(yīng)激損傷[13]。

課題組前期研究中已建立NSC的高銅負荷模型，并開展了相關(guān)實驗，最終選用200 μmol/L銅負荷劑量，可導(dǎo)致線粒體跨膜電位降低，但不會對體外培養(yǎng)細胞存活率造成影響[10]。在此基礎(chǔ)上，我們制備低、中、高劑量肝豆靈藥物血清，研究結(jié)果顯示，高銅負荷可使小鼠NSC細胞增殖率下降，ROS含量升高，Nrf2 mRNA和蛋白表達下降。不同劑量肝豆靈可通過降低ROS，提高Nrf2的表達，從而促進小鼠NSC的增殖。從該層面闡明肝豆靈治療Wilson病神經(jīng)損傷的分子機制，鑒定高銅誘導(dǎo)神經(jīng)毒性所致的神經(jīng)病理變化的干預(yù)靶點。肝豆靈作用于NSC這個靶點的機制在于干擾了ROS水平；Nrf2作為有效降低NSC中ROS的元件，是肝豆靈作用的有效靶點分子；肝豆靈干擾Nrf2的水平可有效緩解Wilson病，表明上調(diào)Wilson病中低表達甚至沉默的Nrf2將為Wilson病的靶向干預(yù)提供新的理論和實踐依據(jù)。在下一步研究中，我們將引入Nrf2-/-神經(jīng)元干細胞模型，對鑒定出的Nrf2及其下游的分子靶點進行干預(yù)，進而驗證肝豆靈能否讓NSC免受ROS損傷。

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（收稿日期：2018-01-07）

（修回日期：2018-01-29；編輯：華強）