柴達木黑果枸杞原花青素對小鼠衰老皮膚抗氧化作用及炎癥因子的影響※

王 剛，羅文娟，冶 娟， 燕華玲

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，西寧 810001)

近年來對柴達木黑果枸杞的研究主要集中在抗氧化方面。本研究探討柴達木黑果枸杞原花青素對皮下注射5%D-半乳糖(D-gal)聯(lián)合紫外線(長波紫外線UVA+中波紫外線UVB)照射后小鼠皮膚抗氧化作用及炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF及KM雌鼠50只，45日齡，體重18～22 g，購于西安交通大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：0001209。

1.2 主要試劑與儀器

柴達木黑果枸杞原花青素粉末(西安瑞林生物公司)，水溶性維生素E粉末、D-半乳糖(北京索萊寶生物公司)，SOD、GSH、CAT試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠IL-1、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測試盒(武漢基因美生物科技有限公司)。infinite M200PRO酶標(biāo)儀(TECAN公司)，紫外線輻照儀(北京精密儀器有限公司)，UVA、UVB燈管(峰波長值分別為340、313nm，南京卡知電子科技有限公司)，DU800分光光度計(BECKMAN COULTER公司)，手持勻漿儀(無錫沃信儀器有限公司)，BB150二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，SIGMA 3K15離心機(SIGMA公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及脫毛

將50只小鼠隨機分為5組：正常組，模型組，維生素E組，原花青素低劑量組，原花青素高劑量組。剪去小鼠頸背部長毛，用雙蒸水和75%酒精為溶媒配置4%的硫化鈉溶液，均勻涂抹于頸背部毛發(fā)上，范圍約2 cm×3 cm，待毛發(fā)略透明呈淡黃色后(約6～8min)，用棉球擦去毛發(fā)、流動溫水沖洗。

1.3.2 模型的建立

除正常組外，其余組以5% D-gal于頸背部皮下注射(10mL/kg·d)，隔日進行UV照射：將UVA、UVB燈管各一支平行安插在自制照光箱中，距鼠約40 cm高處，以最小紅斑量開始照射，照射前預(yù)熱燈管15 min，照射40 min，隔日1次，持續(xù)造模40 d(UVA累計輻照劑量為98.4J，UVB累計輻照劑量為78.4J)。正常組小鼠在室溫光照下飼養(yǎng)。實驗始至第11天按分組給予不同溶液灌胃(3mL/只·天)：維生素E組給予維生素E(50mg/kg·d)，原花青素低劑量組給予低量原花青素(50mg/kg·d)，原花青素高劑量組給予多量原花青素(100mg/kg·d)，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.3 取材及10%組織勻漿的制備

造模第41天，對小鼠行腹腔麻醉，冰上快速取下頸背部造模處皮膚組織，鈍性剝除皮下脂肪及其他結(jié)締組織，漂洗，拭干，精密稱重，置于試管中，加入9倍預(yù)冷生理鹽水，在冰水浴中勻漿，制備組織勻漿(10%)，離心(3500r/min)15 min，取上清液進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3.4 指標(biāo)檢測

嚴(yán)格參照相應(yīng)試劑盒說明書以酶生化法檢測皮膚組織上清液中SOD、GSH-PX、CAT活力，用雙抗體夾心ELISA法檢測IL-1、IL-6含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 皮膚組織上清液SOD、CAT活力及GSH-PX含量的改變

模型組SOD、CAT活力和GSH-PX含量較正常組降低(P<0.05)；與模型組相比，經(jīng)維生素E及原花青素灌胃后皮膚組織上清液中的SOD、CAT活力和GSH-PX含量有不同程度升高(P<0.05)；原花青素低劑量組和高劑量組SOD、CAT活力和GSH-PX含量較維生素E組升高更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

Table 1Comparison of the contents of SOD，CAT and GSH-PX among different

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與維生素E組比較，P<0.05。

2.2 各組IL-1和IL-6含量的變化

模型組IL-1、IL-6含量較正常組升高(P<0.05)；維生素E組、原花青素低劑量組、原花青素高劑量組的IL-1、IL-6含量較模型組有不同程度的降低(P<0.05)；原花青素低劑量組、高劑量組IL-1、IL-6含量較維生素E組降低幅度更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2 表2

Table 2Comparison of the skin contents of IL-1 and IL-6 among in different

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與維生素E組比較，P<0.05。

3 討論

皮膚老化按其來源可分為內(nèi)源性和外源性老化兩種形式[1]。內(nèi)源性老化受基因調(diào)控，取決于細(xì)胞的自然老化過程。外源性老化主要受外界因素的影響，其中最主要因素是紫外線輻射。紫外線是波長為100～400 nm的一組光源，按波長可分為長波紫外線(UVA 320～400nm)、中波紫外線(UVB 280～320nm)、短波紫外線(UVC 100～280nm)。平流層的臭氧可吸收波長小于290 nm的紫外線，因此真正能夠到達皮膚表皮的是UVA和UVB[2]。本研究以小鼠為研究對象，采用5% D-gal連續(xù)皮下注射聯(lián)合UV照射小鼠頸背部脫毛區(qū)域，共同建立小鼠皮膚衰老模型，綜合內(nèi)、外源性因素共同作用導(dǎo)致皮膚老化，全面的模擬皮膚衰老的真實自然狀態(tài)。

正常情況下，機體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被打破時，機體即表現(xiàn)出氧化損傷，其中SOD、GSH、CAT等抗氧化酶反映了機體抗氧化水平。既往研究表明，長期大量注射D-半乳糖及輻射過量的紫外線均可促使機體生成許多活性氧(ROS)，攻擊體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化與抗氧化反應(yīng)失衡，使得體內(nèi)抗氧化酶消耗增多、含量降低、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物蓄積[3-4]。ROS的蓄積可導(dǎo)致細(xì)胞組成成分如細(xì)胞膜、線粒體、DNA氧化損傷，激活細(xì)胞因子和生長因子受體[5-6]。相關(guān)研究表明，UV照射可激活NF-kB通路和AP-1的表達，促進炎性細(xì)胞因子IL-1B、TNF-a、IL-6、IL-8及各種黏附因子的表達，這些炎性細(xì)胞因子的激活進一步擴大NF-kB通路和AP-1的表達，增強UV對皮膚的損傷[7]。本實驗中，經(jīng)過5%D-半乳糖聯(lián)合UV(UVA+UVB)照射后，模型組皮膚組織上清液中SOD、CAT活力值及GSH含量值明顯下降，IL-1、IL-6含量升高，說明UV和D-半乳糖可破壞機體的酶防御系統(tǒng)，上調(diào)炎癥因子IL-1、IL-6的表達，造成機體的損傷，加速皮膚的老化。給予原花青素、維生素E灌胃處理后皮膚組織上清液中SOD、CAT活力和GSH含量值與模型組相比有不同程度的升高，IL-1、IL-6的表達均明顯下降；且原花青素低、高劑量組較維生素E組效果更明顯。說明黑果枸杞原花青素及維生素E均可保護小鼠機體的酶防御系統(tǒng)，不同程度地提高機體抗氧化損傷的能力，增加體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的活性和含量，降低炎癥因子的表達，減輕對小鼠皮膚的損傷，延緩皮膚衰老。黑果枸杞原花青素的抗老化效果顯著高于維生素E，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。

綜上所述，柴達木黑果枸杞原花青素及維生素E均能減輕D-半乳糖和紫外線對小鼠皮膚的損害，減緩小鼠皮膚衰老的進程，這與增加抗氧化酶活性及含量，同時下調(diào)IL-1、IL-6的表達，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實驗以青海地區(qū)自然環(huán)境及本地藥物資源為出發(fā)點，為青海柴達木黑果枸杞原花青素的抗老化作用提供實驗依據(jù)。因本實驗研究條件有限，未做深入研究。下一步擬從基因表達、相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面開展研究。