佐兆杭，王 穎,2,*，劉淑婷，宮 雪，周 義，張艷莉，王 迪，曹龍奎,2,*

隨著生活水平的不斷提高，消費者的飲食結(jié)構(gòu)也隨之變化，大量攝入的高糖、高脂食物導致了糖尿病發(fā)病率的急速上升[1-2]，預計在2010—2030年期間，發(fā)展中國家會增加69%的糖尿病患者[3-4]。糖尿病是由胰島素（insulin，INS）分泌功能障礙導致的一種以高血糖為特征的終身性疾病，目前尚無根治糖尿病的方法[5-7]。臨床上用于治療糖尿病的藥物多為化學合成的西藥，雖然短期降糖效果顯著，但常伴有多種毒副作用[8-9]。因此，尋找一種能有效降糖且安全、廉價的天然產(chǎn)物，對于治療糖尿病具有重要意義。

膳食纖維是具有抗消化特性且在小腸中不能消化的碳水化合物或其類似物，包括一部分不能消化的多糖、低聚糖及其他植物締合物[10]。膳食纖維對人體健康有重要作用，其生理功能主要有：控制體質(zhì)量、防止便秘、防治結(jié)腸癌、清除外源物質(zhì)及防治糖尿病、高血壓、心臟病和動脈硬化等[11-13]。研究表明，膳食纖維具有調(diào)節(jié)餐后血糖、升高血清INS水平及維持血糖平衡和穩(wěn)定等功能[14]。因此，國際糖尿病組織極力推薦以膳食纖維為基礎(chǔ)的飲食治療作為糖尿病的基礎(chǔ)療法[15]。目前對單種膳食纖維防治糖尿病的研究較為熱門，但對于雜豆膳食纖維的降糖效果及其作用機制的研究卻較為罕見。雜糧、雜豆一般是指小麥、稻谷、玉米和大豆四大糧食以外的其他谷物和豆類。其中，雜豆包括綠豆、黑豆、蕓豆、豌豆、蠶豆等食用豆類[16]。雜豆營養(yǎng)豐富，膳食纖維含量較高。本實驗以糖尿病模型大鼠為研究對象，對雜豆膳食纖維的降血糖效果進行研究，旨在為雜豆膳食纖維在降血糖方面的作用提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Wistar純系大鼠，體質(zhì)量（250±10）g，批準號：SCXK（吉）2016-0008，購自長春生物制品研究所有限責任公司。

雜豆膳食纖維粉（可溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)70%）國家雜糧工程技術(shù)研究中心；鏈脲佐菌素 美國Sigma公司；優(yōu)降糖（格列本脲片） 浙江嘉興生化制藥廠；大鼠血清INS測試盒、肝糖原測試盒、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）測試盒 蘇州卡爾文生物技術(shù)有限公司；肝素鈉、二甲苯、無水乙醇、氨水、蘇木精-伊紅染液 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀及試紙 三諾生物傳感股份有限公司；BS-330全自動生化分析儀 深圳麥瑞有限公司；組織包埋盒江蘇世泰實驗器材有限公司；BS224S型電子天平鶴壁市鑫泰高科儀器制造有限公司；BT100-2J蠕動泵保定蘭格恒流泵有限公司；KD-TS3A生物組織脫水機北京佳源興業(yè)科技有限公司；KD-BM生物組織包埋機、KD-P攤片機 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機 德國Leica公司；CK40型光學顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 雜豆膳食纖維的提取

本實驗中的雜豆膳食纖維主要提取工藝流程：成熟蕓豆、黑豆、綠豆（1∶1∶1，m/m）→烘干→粉碎→過篩→α-淀粉酶處理→糖化酶處理→蛋白酶處理→脫水、干燥、稱質(zhì)量→超微粉碎→成分測定[17]→雜豆膳食纖維粉。

1.3.2 模型建立與飼養(yǎng)

選擇6 月齡健康雄性Wistar大鼠50 只，體質(zhì)量（250±20）g。適應性飼養(yǎng)一周后，稱量體質(zhì)量，按體質(zhì)量隨機抽取6 只作為空白組，其余大鼠禁食12 h后，腹腔注射鏈脲佐菌素溶液（質(zhì)量分數(shù)2%）（150 mg/kg mb），并恢復進食，進食72 h后再次禁食12 h，空腹尾部靜脈取血測定其血糖值，選取空腹血糖值不小于16.7 mmol/L的實驗大鼠（30 只）作為高血糖模型大鼠[18]。共分為5 組（模型組、格列本脲組和雜豆膳食纖維低、中、高劑量組），每組6 只?？瞻捉M及模型組灌胃給予生理鹽水（質(zhì)量分數(shù)0.9% NaCl），格列本脲組灌胃格列本脲（10 mg/kg mb），雜豆膳食纖維組分別灌胃給予不同劑量（1.35、2.70、5.40 g/kg mb）雜豆膳食纖維溶液，灌胃劑量為1 mL/只，連續(xù)灌胃42 d。實驗大鼠飼養(yǎng)于實驗專用塑料鼠籠，各組實驗大鼠以標準飼料飼喂，自由飲水，每周定時稱量大鼠體質(zhì)量1 次。室溫環(huán)境（24±2）℃，相對濕度（45±3）%，光照12 h/d。

1.3.3 動物檢測指標測定

1.3.3.1 動物體質(zhì)量的測定

實驗期間觀察實驗大鼠日常行為狀況并記錄，末次給藥并禁食禁水24 h后，稱量大鼠體質(zhì)量并按照實驗組分別記錄[19]。

1.3.3.2 動物降血糖指標的測定

腹主動脈取血法采血，部分血液樣本用以測量空腹血糖值，其余血液樣本分離血清，試劑盒測定INS含量、肝糖原質(zhì)量濃度、GSP濃度。

1.3.3.3 動物胰臟組織切片的檢測

取出大鼠胰腺組織并稱質(zhì)量，計算胰腺/體質(zhì)量（即大鼠胰腺濕質(zhì)量與體質(zhì)量的比值）并將胰腺組織固定于體積分數(shù)10%甲醛溶液中用以制作蘇木精-伊紅染色切片，光學顯微鏡下觀察胰腺組織胰島區(qū)域病理學變化[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，Origin軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠體質(zhì)量

圖1 各組大鼠體質(zhì)量指標Fig. 1 Body mass of experimental rats in each group

如圖1所示，糖尿病型大鼠建模成功后，體質(zhì)量明顯下降，模型組大鼠與空白組大鼠間存在極顯著差異（P＜0.01）。經(jīng)灌胃給予不同劑量雜豆膳食纖維及格列本脲后，除低劑量雜豆膳食纖維劑量組外，各灌胃劑量組大鼠體質(zhì)量均較模型組極顯著升高（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠空腹血糖指標

圖2 各組大鼠空腹血糖值Fig. 2 Fasting blood glucose of rats in each group

空腹血糖值是指在空腹情況下采血所檢定的血糖值，能夠較好地反映被檢對象的真實血糖水平。本實驗采用血糖儀測定各組大鼠空腹血糖值，以表征雜豆膳食纖維對糖尿病大鼠的降糖作用。如圖2所示，模型組大鼠空腹血糖值較空白組具有極顯著差異（P＜0.01），灌胃后，低劑量雜豆膳食纖維劑量組較模型組空腹血糖值顯著下降（P＜0.05），中、高劑量雜豆膳食纖維劑量組及格列本脲組大鼠空腹血糖值均較模型組極顯著下降（P＜0.01），該結(jié)果表明雜豆膳食纖維可顯著降低糖尿病型大鼠空腹血糖值。

2.3 各組大鼠胰腺/體質(zhì)量

圖3 各組大鼠胰腺/體質(zhì)量Fig. 3 Pancreas to body mass ratio of rats in each group

臟體比即大鼠臟器濕質(zhì)量與大鼠體質(zhì)量的比值，可反映出糖尿病對各臟器的損傷情況。由圖3可知，模型組大鼠胰腺/體質(zhì)量較空白組大鼠顯著降低，灌胃后，各灌胃劑量組大鼠胰腺/體質(zhì)量均較模型組大鼠不同程度升高，格列本脲組大鼠胰腺/體質(zhì)量較模型組大鼠顯著升高（P＜0.05），中、高劑量雜豆膳食纖維劑量組大鼠與模型組大鼠胰腺/體質(zhì)量差異顯著（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠血清檢測指標

圖4 各組大鼠血清GSP（A）、INS（B）及肝糖原（C）水平Fig. 4 GSP (A), INS (B) and hepatic glycogen (C) levels of rats in each group

如圖4所示，模型組大鼠較空白組大鼠血清肝糖原質(zhì)量濃度及INS含量極顯著降低，血清GSP濃度極顯著升高（P＜0.01）。灌胃后，各灌胃劑量組大鼠血清肝糖原質(zhì)量濃度及INS含量均較模型組大鼠不同程度上升，除低劑量雜豆膳食纖維劑量組外，格列本脲組及中、高劑量雜豆膳食纖維劑量組大鼠血清肝糖原質(zhì)量濃度均較模型組大鼠極顯著上升（P＜0.01），血清INS含量除低劑量雜豆膳食纖維劑量組外，其他各灌胃劑量組大鼠血清INS含量均較模型組大鼠極顯著上升（P＜0.01）。血清GSP濃度除低劑量組外，格列本脲組及其他雜豆膳食纖維劑量組大鼠均較模型組大鼠顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學變化

圖5 大鼠胰腺組織病理學觀察結(jié)果（×100）Fig. 5 Histopathological observation of pancreas tissues in rats (× 100)

如圖5所示，空白組大鼠的胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，胰島細胞緊密且形態(tài)正常、大小均一。模型組大鼠的胰腺組織損傷嚴重，胰島萎縮，僅有少數(shù)胰島細胞殘留，且細胞水腫變形，細胞間隙存在出血點及炎性細胞浸潤現(xiàn)象；灌胃后，與模型組大鼠相比，各灌胃劑量組大鼠胰腺組織損傷程度明顯減輕，胰島細胞數(shù)目增多，且細胞水腫變形程度改善，細胞間隙偶有炎性細胞浸潤現(xiàn)象。胰腺病理學切片結(jié)果表明：雜豆膳食纖維可改善糖尿病對大鼠胰腺的損傷情況。

3 討 論

研究顯示，膳食纖維攝入量是2型糖尿病發(fā)病的重要預測因子之一[21]。膳食纖維含量也可反映食物血糖生成指數(shù)高低，而血糖生成指數(shù)與糖尿病密切相關(guān)[22]，高血糖生成指數(shù)膳食會增加患2型糖尿病危險性[23]。血糖生成指數(shù)代表碳水化合物食物升高血糖能力，血糖升高幅度決定INS分泌量[24]。在2型糖尿病患者中，血糖升高過快導致INS分泌功能受損。研究證實，低血糖生成指數(shù)食物可降低空腹和餐后INS及血糖水平，同時可改善INS介導葡萄糖攝取，改善糖尿病患者、肥胖者INS敏感性[25]。一般而言，食物中膳食纖維含量越高，血糖生成指數(shù)就越低，即不易引致血糖升高；膳食纖維含量越低，血糖生成指數(shù)就越高，即容易引起血糖升高[26]。相關(guān)研究表明攝入膳食纖維可有效延緩和降低餐后血糖和血清INS水平的升高，改善葡萄糖耐量曲線，維持餐后血糖水平的平衡與穩(wěn)定[27]。

大鼠空腹血糖值及相關(guān)指標的檢測結(jié)果表明膳食纖維具有較好的調(diào)節(jié)血糖的功效。分析其原因可能是動物體攝入膳食纖維后，吸水膨脹形成凝膠過濾系統(tǒng)，增加腸道內(nèi)容物的勃度，延長胃排空時間，縮短食物在胃腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運時間[28]，從而抑制營養(yǎng)物質(zhì)像胃腸道勃膜表面擴散，使葡萄糖進入小腸上皮吸收細胞的速率下降，葡萄糖吸收速率被延緩，從而顯著降低空腹血糖水平。本實驗通過建立大鼠鏈脲佐菌素糖尿病模型，研究了雜豆膳食纖維對糖尿病大鼠的影響。結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，除低劑量雜豆膳食纖維劑量組外，各灌胃給藥組大鼠體質(zhì)量均較模型組升高，差異極顯著（P＜0.01）；低劑量雜豆膳食纖維劑量組較模型組空腹血糖值顯著下降（P＜0.05），中、高劑量雜豆膳食纖維劑量組及格列本脲組大鼠空腹血糖值均較模型組下降，且差異極顯著（P＜0.01）。實驗結(jié)果表明，雜豆膳食纖維具有較好的降低糖尿病大鼠空腹血糖的效果，且其降糖效果與劑量呈正相關(guān)。

GSP是血液中的各種蛋白與葡萄糖發(fā)生緩慢非酶促反應的產(chǎn)物，可反映1～2 個月內(nèi)糖尿病患者血糖控制水平，是糖尿病檢測靈敏指標之一，血液中GSP水平較高，表示糖尿病患者處于持續(xù)高血糖狀態(tài)。有研究指出，肝糖原合成減少，糖異生增多以及肝脂肪合成減少、分解增多是血糖濃度升高的主要原因之一。血清INS能抑制體內(nèi)葡萄糖的產(chǎn)生并刺激體內(nèi)組織攝取葡萄糖，增加肝糖原的合成能力從而降低血糖濃度[29-30]。實驗結(jié)果顯示，灌胃給予雜豆膳食纖維后，中、高劑量組大鼠與模型組相比，血清肝糖原質(zhì)量濃度及INS含量極顯著升高（P＜0.01），GSP濃度顯著降低（P＜0.05），且變化程度與給藥劑量呈正相關(guān)趨勢，從而進一步證明了一定劑量的雜豆膳食纖維具有促進肝糖原合成、降低血糖水平的能力。胰腺組織病理學切片觀察得知，各灌胃給藥組大鼠胰腺組織損傷程度明顯減輕，胰島細胞數(shù)目增多，細胞水腫變形程度顯著改善，結(jié)合大鼠胰腺/體質(zhì)量指標分析：各劑量組大鼠灌胃后，胰腺/體質(zhì)量均較模型組大鼠不同程度升高，中、高劑量組升高程度顯著（P＜0.05）。說明雜豆膳食纖維對糖尿病大鼠的胰腺組織損傷具有修復作用，可提升其細胞活力，恢復胰島細胞感受態(tài)。

綜上所述，雜豆膳食纖維具有良好的降低糖尿病大鼠血糖的作用，機制與修復胰島組織細胞氧化損傷有關(guān)。本實驗為雜豆膳食纖維作為具有調(diào)節(jié)血糖作用的功能性食品的后續(xù)研發(fā)提供了理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。