汪超甲 王輝

[摘要] 腦膠質瘤是顱內最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，目前的手術、化療、放療效果欠佳，基因治療可能成為未來腦膠質瘤的重要發(fā)展方向。現有的基因編輯技術有RNA干擾、TALEN、ZENs等，由于其設計操作復雜且脫靶率高，一直沒能得到很好的應用。（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)。通過對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫，較上述的幾種方法，具有明顯的優(yōu)勢。本文就CRISPR/Cas9的結構功能及在腦膠質瘤治療中的應用作一綜述，以期為腦膠質的治療提供新途徑。

[關鍵詞] CRISPR/Cas9；結構功能；腦膠質瘤；應用進展

[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（c）-0024-04

[Abstrict] Glioma is the most common primary malignant tumor of the brain. Currently， surgery， chemotherapy and radiotherapy are not effective. Gene therapy may become an important development direction of glioma in the future. The existing gene editing techniques have RNA interference， TALEN， ZENs and so on. Because of their complex design operation and high miss distance， they have not been used well. （CRISPR） /CRISPR-associated （Cas） 9 is a natural immune system for many bacteria and most of the palaeophytes. By specific identification of the invaded virus and nucleic acid， the Cas protein is used to cut the virus to achieve its own immunity. Compared with the above methods， it has obvious advantages. This article reviews the structure and function of CRISPR/Cas9 and its application in the treatment of glioma， in order to provide a new therapeutic approach for the treatment of brain glia.

[Key words] CRISPR/Cas9； Structural function； Glioma； Application progress

腦膠質瘤是顱內發(fā)病率及惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤。由于其發(fā)病機制不詳，不能得到徹底治愈。研究發(fā)現其發(fā)生、發(fā)展和多因素、多基因的共同作用密切相關[1]。為了能夠徹底治愈，就必須明確這些基因、因素的作用機制以及它們之間的相互作用，基因編輯技術的快速發(fā)展使得其成為可能。RNA干擾技術可以將目的基因沉默，使其功能減低，來研究基因在疾病中的作用。TALEN和ZFNs技術則通過對目標基因的相應片段進行敲除，使基因功能徹底喪失，進一步明確該基因的作用。CRISPR/Cas是新近發(fā)展起來的第3代基因編輯工具，可以對單基因或者多基因同時進行定點的插入、敲除、替換，更為簡單、高效，并很快成為研究熱點被廣泛應用于腫瘤及遺傳性疾病的研究中。本文從CRISPR/Cas的發(fā)現歷史、結構功能、作用機制及應用，及其在腦膠質中的應用進展等方面進行綜述，旨在為進一步的研究提供理論依據，也為從基因角度治愈腦膠質瘤帶來曙光。

1 CRISPR/Cas的發(fā)現

CRISPR/Cas全稱多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列相關蛋白，是細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。早在1987年，日本科學家在對細菌編碼的堿性磷酸酶研究時就發(fā)現了串聯(lián)間隔重復序列，但其功能一直未解[2]。直到2002年，這種序列才廣泛在細菌和古生菌中發(fā)現，由此命名為CRISPR系統(tǒng)[3]。CRISPR/Cas9最早在乳酸菌中發(fā)現。2005年，有3個研究組同時發(fā)現串聯(lián)間隔重復序列和外源pageDNA片段及侵染細菌的病毒具有高度同源特性。從而判斷，這可能是類似siRNA免疫防御一樣，是細菌抵抗外源page片段的一種機制。2013年這一系統(tǒng)在《Cell》被報道后[4]，至此，CRISPR/Cas系統(tǒng)逐漸被認識并應用于各種研究領域。

2 CRISPR/cas9系統(tǒng)的結構

CRISPR/Cas系統(tǒng)總共分為三類，CRISPR/cas9是其中第二類，應用最為廣泛[5]。除共有的基因Cas1和Cas2外，只需要一種CRISPR相關蛋白即Cas9蛋白；而一類和三類的標記基因分別為Cas3和Cas10，除此之外還需要多種相關Cas蛋白，所以相對來說CRISPR/cas9結構更加簡單，應用更加普遍[6]。CRISPR-Cas通常由識別和切割功能的兩個重要部分組成。CRISPR位點由短的高度保守的重復序列組成，重復序列的長度一般為21～48 bp，之間被26～72 bp間隔序列隔開。不同細菌具有不同的重復序列及間隔序列，呈多樣性。CRISPR就是通過這些間隔序列與靶基因進行識別。而切割部分cas蛋白存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，含有兩個核酸酶結構域，能夠分開切割雙鏈DNA的兩條核苷酸單鏈，即由gRNA引導并對靶位點進行切割。各類CRISPR-cas的剪切位點通常位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(qū)。不同類型的CRISPR-cas系統(tǒng)有著各自的PAM序列。就二型來說Cas蛋白由cas9單獨構成，其PAM區(qū)以5′-GG-N18-NGG-3′為典型特征。在人類基因組中，平均每隔128 bp就出現1個NGG PAM，為靶點選擇提供了方便[7]。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機制

CRISPR/Cas9作用機制可分為3個階段：適應階段、表達階段和干擾階段[8]。

適應階段：當宿主菌受外源物質入侵后，外源質?；蚴删w上的一小段DNA序列會以非同源重組的方式被整合到宿主菌的基因組中，整合的位置位于前導序列與第一個重復序列之間[9]，且每插入一段外源序列都會伴隨著一次重復序列的復制，從而形成新的R-S結構。這一過程使得宿主CRISPR含有外源序列信息，為干擾階段發(fā)揮作用提供基礎。宿主對外源DNA序列的選擇也并非隨機的，有研究發(fā)現在前間區(qū)序列附近含有一些特定序列稱為前間區(qū)序列鄰近序列（protospacer adjacent motifs，PAMs）[10]，不同CRISPR亞型對于PAM的識別具有特異性。

表達階段：CRISPR基因座首先被轉錄成一段長鏈的RNA，稱為CRISPR RNA前體（Pre-crRNA），同時Cas蛋白將形成一個具有內切酶功能的復合物，特異性地將crRNA切割加工成小的成熟crRNA。成熟的crRNA會與Cas蛋白復合物結合形成具有特殊功能的Cas/crRNA作用復合體，在干擾階段發(fā)揮作用[9]。

干擾階段：當宿主再次接觸到外界噬菌體或質粒時，crRNA便會與其同源的外源核酸特異性結合，而后通過Cas/crRNA作用復合體將外源核酸切割成碎片，使其無法行使功能，從而達到保護宿主基因組的目的[9]。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用

4.1 原始的Cas9介導的基因編輯

此過程主要分為兩步：①在特定的區(qū)域由crRNA中的20nt的靶位對目標序列進行識別，而后被Cas9切割產生DB S[11]。②由修復系統(tǒng)對DBS進行修復。主要有NHEJ和HDR兩種修復方式。NHEJ作為有錯誤傾向的過程，經常產生非限制性的小的插入或者缺失，從而導致功能的異常。HDR修復則表現為精確的編輯，它們會產生限制性的缺失、插入或者是核酸的替代[12]。在此之前，首先它們要在外來的宿主中表達。不同物種、不同組織器官表達差異很大[13]。

4.2 核酸內切酶介導的基因編輯

伴有RUVC和HNH突變的RNA指導的Cas9n具有在目標區(qū)產生的是單切口[14]。這種切口可以通過HDR途徑非常成功的進行修復編輯[15]。引入一對gRNA指導性的CAS9n產生的DSBs可以通過NHEJ產生突變，較單一的Cas9n介導的HDR效率顯著提高，且可以改善人類細胞的脫靶率高達50～1500倍。因為雙切口產生的可預測的有限制黏性末端，通過NHEJ介導的連接，可以提供有兼容的突出末端的雙鏈修復模板，也可以成功的將HDR非依賴的片段在特定區(qū)域整合[13]。因此利用Cas9n多個切口的產生可以進行更高精準度的基因編輯[13]。

4.3 非活化的Cas9為基礎的轉錄調控

CRISPR/Cas系統(tǒng)也被發(fā)展成為在不改變目標基因序列的基礎上的一種新型的便捷的多種途徑重復使用的轉錄調控方式，被稱作CRISPR干擾[16]。由完全滅活的dCas9和特定的gRNA（或者是tracrRNA：crRNA復合體）組成。它雖失去了核酸內切酶的活性，但與gRNA結合和與目標序列的綁定的能力并不受影響。和RNAi一樣，其取決于堿基配對的互補性對目標部位的識別。RNAi主要引起轉錄本的降解和或者翻譯的受阻。但是CRSPRi阻止了轉錄的起始和延伸[17]。通過設計多對gRNA，使同時調節(jié)多基因成為可能。dCas9介導的轉錄調控在肺炎鏈球菌中得到驗證，聯(lián)合兩個gRNA同時作用同一基因可能使沉默效率達到1000倍。因此，CRISPRi在基因轉錄水平調控基因表達是非常有前景的通用方法。

4.4 以Cas9為基礎的高通量正向遺傳篩查

截至目前，所有以Cas9為基礎的工具都顯示出有強大的加強各種遺傳及合成生物學的能力。鑒于此，利用多功能的Cas9各種相關產物創(chuàng)建突變庫，用來檢測或者鑒定與遺傳要素有關的基因譜的表現型是非常有可能的[18]。為了得到高通量的目標序列，構建高度特異性的gRNA庫是非常重要的。讓原始的Cas9和gRNA在宿主中共表達可以產生丟失功能的突變庫[19]。如果dCas9或者有Cas9效應的嵌合體被應用，可以產生基因敲低或者激活引起突變。相比于失去功能的突變庫，這些突變在研究致死基因上有難以比擬的優(yōu)勢[20]。

4.5 CR.ISPR/Cas9應用的影響因素

影響Cas9基因編輯工具效率和特異性的因素眾多。比如：Cas9的活性、RNA組成的長度和結構、Cas9/RNA的比例、RNA目標序列的互補程度和互補的部位。熟悉這些影響因素有助于指導和改進以后CRISPR的實驗[21]。

4.6 與其它基因編輯工具的比較

用來基因靶向編輯和調節(jié)基因表達的工具根據它們靶向識別的機制，被分成針對特異性蛋白和核苷酸兩大組。鋅指和TALENs是眾所周知的方法。較上述方法Cas9具有以下優(yōu)勢：①只需合成1個sgRNA就能實現對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。②編碼sgRNA的序列不超過100 bp，比構建TALENs和ZFNs更簡單方便。③較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥。但是，它同樣存在脫靶的局限性，為了提高Cas9為基礎的工具效率和特異性，更需要在Cas9工程、優(yōu)化gRNA選擇規(guī)則中付出力度，并進一步闡明Cas9基因組識別特征。

5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在腦膠質瘤中的應用

隨著對該編輯系統(tǒng)的深入了解，人們開始不斷將其應用于對腦膠質瘤的研究方面。通過體內、體外敲除腦膠質瘤中的EGFR，發(fā)現CRISPR/Cas9對于富含EGFR或者是EGFR突變的患者來說都具有很好的治療前景[22]；同時敲除小鼠大腦中Trp53、Pten、Nf1等基因可以促進腦膠質瘤的發(fā)展，進一步證實這些抑癌基因在腦膠質瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用[23]；對腦膠質瘤干細胞中特定基因的敲除，再次證實了了腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生的種子[24]；MiR-10b及MiR24-3p基因的敲除揭示了MiR參與調控了腦膠質瘤的增殖及侵襲的特性[25]；轉座子PiggyBac與CRISPR/Cas9的結合使得腦膠質瘤中的突變可能得到糾正[26]；高通量正向篩查為腦膠質瘤化療耐藥的篩選提供了更便捷的方法[27]，通過對腦膠質細胞中CXCR4及PYK2等基因的敲除，發(fā)現這些基因在腦膠質細胞的生長、遷移及侵襲能力的影響方面發(fā)揮著重要作用，敲除這些基因后細胞的生長、遷移、侵襲能力較野生型細胞明顯下降。不同級別的腦膠質有著不同的基因突變類型，同一級別不同患者之間也存在著不同遺傳基因的突變，依據這些突變可以將膠質瘤分為不同的基因亞型，不同亞型之間的預后存在差異，估要想做到個體化治療，必須先了解患者的基因亞型?？傊?，利用該編輯系統(tǒng)，可以對腦膠質瘤中的特定基因或者多個進行精準的編輯，探討其功能及調節(jié)機制，也可以利用轉座子或者引入模板序列對突變位點進行修復，還可以進行大量藥物的篩選，為腦膠質瘤的綜合治療提供非常重要的幫助，為開發(fā)新藥提供理論基礎。

6 小結

Cas9具有明顯的優(yōu)點，是目前廣泛使用的靶向工具不能比擬的。它大大提高在不同的生物體中設計和編輯基因和調節(jié)基因的表達的能力；為更容易區(qū)分出個體化基因功能鋪平了道路；也將加快對體內冗長的基因的功能和表觀遺傳學研究；使得多基因的編輯變得更高效、簡單，應用領域非常廣泛。盡管以Cas9為基礎的研究工具已被應用在許多模型生物中，但包括分子結構和Cas9的催化機制，PAM的依賴性和gRNA加載機制的幾個基本屬性尚不清楚。了解這些問題將有助于使Cas9編輯工程獨立于PAM之外，擴大我們的選擇目標，并產生高度精確的Cas9 gRNA的復合物，特別是用作人類治療劑。目前所面臨的主要挑戰(zhàn)是脫靶的控制。上述工具是解決這一問題有效的方法[28]。此外，通過高通量的方法全面分析脫靶事件將有助于建立目標序列的選擇規(guī)則、設計和編寫程序。以下幾個方面尚需要進一步評估包括：①GC含量和設計的gRNA二級結構的影響，Cas9/gRNA分子在編輯和沉默效率、特異性上的比率；②不同輸送系統(tǒng)激活Cas9的效果和不同細胞中gRNA的組成；③NHEJ和HDR介導的DSB修復在不同生物中的普遍性和有效性，尤其是在細菌中；④Cas9為基礎的工具，基于高通量的前遺傳學研究的潛在的應用[29]。該工具在腦膠質基因治療方面的研究和利用尚處在初始階段，要充分了解Cas9為基礎的工具并將它們廣泛應用于腦膠質瘤的臨床治療尚需花費更多的精力。

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