中藥白芍親緣性分析及分子鑒定標記的篩選

， ，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

中藥白芍(RadixpaeoniaeAlba)來源于毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根[1].芍藥有益血調(diào)經(jīng)、平肝斂陰的功效，在我國用藥歷史悠久.浙白芍主產(chǎn)于浙江磐安，是著名的“浙八味”，安徽亳州為亳白芍，四川中江為川白芍，皆為道地藥材.在中藥市場上白芍沒有明確的產(chǎn)地劃分，市場上也出現(xiàn)充次亂真的現(xiàn)象[2-3].因此，需要對白芍品種做出準確鑒定，以保證藥材質(zhì)量.RAPD(Random amplified polymorphic DNA)隨機擴增多態(tài)性技術(shù)可直接分析藥用植物基因組DNA的多態(tài)性，篩選得到DNA分子鑒定標記，實現(xiàn)中藥材在基因組的分子水平鑒定的研究[4].

陳丙鑾等[5]應(yīng)用RAPD技術(shù)揭示白芍原植物居群間具有豐富的遺傳多樣性.周紅濤等[6]應(yīng)用該技術(shù)首次揭示芍藥種群的遺傳分化.本實驗以4種中藥白芍為研究對象，選用隨機引物，采用PCR技術(shù)擴增多態(tài)性條帶，旨在揭示白芍遺傳多樣性，并且尋找不同產(chǎn)地白芍的DNA特異性條帶，為今后進一步研究白芍的分類地位、種質(zhì)保護提供在分子水平上的技術(shù)依據(jù)和實踐基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥 材

實驗室于2015年3月—2015年4月分別向浙江磐安、安徽亳州、山東菏澤和四川中江4個白芍主產(chǎn)地購買新鮮的芍藥植株.新鮮嫩葉經(jīng)硅膠快速干燥，保存于-70 ℃冰箱備用.以上芍藥品種經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院華允芬副教授鑒定為正品.藥材信息詳見表1.

表1 4 種白芍的產(chǎn)地Table 1 Origins of four kinds of Paeonia lactiflora Pall.

1.1.2 儀器與試劑

PCR相關(guān)試劑，快速植物基因組提取試劑盒購自生工?生物工程(上海)有限公司；RAPD隨機引物由生工?生物工程(上海)有限公司合成.實驗中的儀器包括PCR擴增儀MyCycleTMThermal Cycler，電泳儀Power PacTMBasic和凝膠成像系統(tǒng)Molecular Imager?Gel DocTMXR+System，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品.

1.2 實驗方法

1.2.1 白芍DNA的提取

用電子天平分別稱取110 mg的芍藥新鮮嫩葉(葉片必須事先經(jīng)過饑餓過夜且充分剪碎處理)；置于研缽中，倒入液氮進行充分研磨，研磨至樣品呈粉末；用藥匙迅速轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管，用移液槍先后加入400 μL Buffer PCL Solution和8 μL β-巰基乙醇，充分混勻；于65 ℃的水浴鍋中放置45 min，每隔10 min搖勻1次，第2次搖勻前加入20 μL的RNase A；室溫向離心管中加入200 μL的Buffer PP Solution，混勻后再放置-20 ℃冰箱靜置5 min；室溫10 000 r/min離心5 min，取上清液移入新的1.5 mL的EP管中；分別向每管中加入與上清液等體積的異丙醇(-20 ℃預(yù)冷)，顛倒混勻后放入4 ℃冰箱里過夜；室溫10 000 r/min離心5 min，留沉淀，加入1 mL的75 %乙醇漂洗；室溫10 000 r/min離心2 min，棄上清，此步驟重復(fù)一次；留沉淀倒置使EP管中的乙醇完全揮發(fā)為止；向每管加入50 μL的TE Buffer溶解DNA，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 白芍DNA質(zhì)量檢測

制備質(zhì)量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠，將DNA樣品與上樣液混合后加入加樣孔中，凝膠在TAE緩沖液中電泳55 min.電泳結(jié)束后將膠塊浸沒于EB染色液中染色10 min，取出后用清水漂洗數(shù)次，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，拍照留存.通過電泳結(jié)果可以初步估計DNA的質(zhì)量，使用紫外-可見光分光光度法可以獲得DNA的純度.DNA樣品經(jīng)過稀釋后，放入紫外-可見光分光光度計中測定260 nm和280 nm波長處的吸光度，計算基因組DNA樣品的純度，計算式為DNA質(zhì)量濃度=A260×稀釋倍數(shù)×50.

1.2.3 PCR擴增

以4種白芍基因組DNA為模板，選用隨機寡核苷酸引物進行RAPD擴增[7-9].RAPD擴增體系參考文獻報道[10-12]，體系為10×PCR buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.2 μL， dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μL，模板DNA(50 ng/μL) 1.2 μL，引物 (20 μmol/L) 0.5 μL，Taq plus DNA polymerase(5 U/μL) 1.5 U，最后加已滅菌的ddH2O至20 μL.PCR程序設(shè)置為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 45 s，40 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，44個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存.PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，再經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并拍照留存.

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

根據(jù)PCR擴增條帶的遷移程度，確定4種白芍RAPD擴增條帶的位置和相對分子質(zhì)量大小.同一引物的擴增產(chǎn)物在電泳中遷移相同距離，即認為是有同源性，按條帶的有無分別賦值，有帶(包括弱帶)記為“1”，無帶記為“0”，形成二元數(shù)據(jù)矩陣.利用 NTsys2.10e 軟件計算出4 種白芍之間的遺傳相似性系數(shù).

2 實驗結(jié)果

2.1 白芍DNA提取及質(zhì)量檢測

植物基因組提取按快速植物基因組提取試劑盒說明書操作，基因組DNA的瓊脂凝膠電泳鑒定結(jié)果，見圖1.從圖1中可知：白芍基因組DNA片段長度完整，條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，說明提取獲得的白芍基因組DNA純度較高，雜質(zhì)含量較少，且DNA分子完整無降解，質(zhì)量較高.由紫外-可見光分光光度法測定白芍基因組DNA的相關(guān)數(shù)據(jù)見表2.表2的數(shù)據(jù)顯示了4種白芍基因組DNA的OD260/OD280值均在1.8～1.9，DNA質(zhì)量濃度在100～250 μg/mL，說明白芍基因組的質(zhì)量較好，純度較高，為實驗研究提供較優(yōu)質(zhì)量的模板.

1—Marker；2—浙白芍基因組DNA；3—亳白芍基因組DNA；4—山白芍基因組DNA；5—川白芍基因組DNA圖1 4種白芍基因組DNA電泳圖Fig.1 Genomic DNA isolated from four kinds of Paeonia lactiflora Pall.

Table2TheconcentrationofgenomicDNAofPaeonialactifloraPall.

序號品種OD260OD280OD260/OD280DNA質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)1浙白芍0.1330.0721.8471332安徽白芍0.2400.1301.8462403山東白芍0.1210.0661.8331214四川白芍0.2370.1271.866237

2.2 隨機引物的篩選

從實驗室大量引物中篩選出比較好的26條隨機寡核苷酸引物，這些引物能擴增出重復(fù)性較好，條帶清晰且多態(tài)性豐富的條帶.篩選出來的引物堿基序列及擴增出來的條帶數(shù)量如表3所示，4種白芍共擴增出385條帶，其中多態(tài)性條帶345條，多態(tài)性比率為89%，說明4個產(chǎn)地的白芍間保存著豐富的遺傳多樣性.

表3用于白芍RAPD實驗的引物序列及擴增結(jié)果

Table3PrimersproducedRAPDpolymorphicbandsandtheresultofamplificationofPaeonialactifloraPall.

引物5'-3'序列總帶數(shù)/條多態(tài)帶數(shù)/條多態(tài)性比率/%S7GGTGACGCAG171588S10CTGCTGGGAC8788S17AGGGAACGAG151280S21CAGGCCCTTC121083S30GTGATCGCAG111091S61TTCGAGCCAG11873S66GAACGGACTC13969S75GACGGATCAG252392S83GAGCCCTCCA1515100S90AGGGCCGTCT151493S140GGTCTAGAGG7686S311GGAGCCTCAG151280S1123AGCCAGGCTG8675S8GTCCACACGG1818100S15GGAGGGTGTT2121100S18CCACAGCAGT222091S26GGTCCCTGAC252392S40GTTGCGATCC181583S65GATGACCGCC2626100S69CTCACCGTCC9889S82GGCACTGAGG131077S84AGCGTGTCTG111091S98GGCTCATGTG121192S230GGACCTGCTG9889S352GTCCCGTGGT1616100S2025GGGCCGAACA131292總計385345

2.3 聚類分析

用NTsys 2.10e軟件對4 種白芍擴增條帶的二元數(shù)據(jù)進行遺傳相似性分析，數(shù)據(jù)如表4所示.4 種白芍兩兩遺傳相似性系數(shù)在0.520 2～0.723 7，其中山東荷澤白芍與安徽亳州白芍遺傳相似性系數(shù)最高，達0.723 7；其次是與四川中江遺傳相似性系數(shù)高達 0.678 3，而與浙江磐安的遺傳相似性系數(shù)較低，只有0.520 2.由遺傳相似系數(shù)越小，兩物種的親緣關(guān)系越遠的理論，山東白芍和安徽白芍的親緣關(guān)系最近，山東白芍和浙江白芍的親緣性關(guān)系最遠.數(shù)據(jù)分析，浙江白芍和安徽白芍的親緣性并不是最近的，說明地理位置不是親緣關(guān)系的主要原因.各地中藥材在種質(zhì)資源的交流，以及同種藥材植株為了適應(yīng)不同氣候環(huán)境而產(chǎn)生的遺傳分化都是導(dǎo)致親緣性遠近差異的原因.

表44種白芍遺傳相似性系數(shù)表

Table4GeneticsimilaritycoefficientofPaeonialactifloraPall.

品種浙江磐安安徽亳州山東菏澤四川中江浙江磐安1.000 00.657 20.520 20.559 2安徽亳州0.657 21.000 00.723 70.668 0山東菏澤0.520 20.723 71.000 00.678 3四川中江0.559 20.668 00.678 31.000 0

2.4 分子鑒定標記的篩選

圖4為引物S17，S7，S61，S98對浙白芍、安徽白芍、山東白芍和四川白芍的RAPD擴增圖譜.引物S17篩選到一條浙白芍的在900 bp的特異性條帶；引物S7篩選一條安徽白芍的在1 800 bp的特異性條帶；引物S61篩選到一條山東白芍的在1 200 bp的特異性條帶；引物S98篩選到一條山東白芍在1 500 bp的特異性條帶.不同產(chǎn)地白芍的擴增存在差異，反映了白芍基因組有一定的差別，可以將這些特異性條帶篩選作為各地的分子標記，說明RAPD技術(shù)可以從DNA水平上檢測不同產(chǎn)地白芍的遺傳變異.

1—Marker；2—浙白芍基因組DNA；3—亳白芍基因組DNA；4—山白芍基因組DNA；5—川基因組DNA圖2 白芍基因組RAPD實驗中的4種引物的擴增結(jié)果Fig.2 Bands produced by four primers in RAPD of amplification of Paeonia lactiflora Pall.

3 結(jié) 論

白芍在中國有大量的栽培種植，分布廣闊，由于不同的地理環(huán)境、氣候條件，逐漸產(chǎn)生遺傳變異.本實驗通過26條引物的擴增圖譜，研究白芍遺傳相似性系數(shù)，結(jié)果表明了4個產(chǎn)地的白芍具有較高的遺傳多樣性.山東荷澤白芍與安徽亳州白芍遺傳相似性系數(shù)最高，而與浙江磐安的遺傳相似性系數(shù)較低，說明藥材交流、長期進化都能成為白芍遺傳分化的原因，這為白芍的遺傳分化提供實踐基礎(chǔ).實驗成功篩選到浙白芍、安徽白芍和山東白芍的分子鑒定標記.目前，將篩選到的分子標記進行下一步的測序工作，實驗可為各地白芍特異性PCR引物的設(shè)計打下基礎(chǔ)，也為其他中藥材品種的分子水平的鑒定研究提供參考.