鏡下單片狀頭屑DNA提取分型法與EZ-tape法的比較

白小剛 ，蹇 慧 ，王 惠 ，毛 炯 ，夏 昱 ，馮 濤 ，陳 丹 ，李慶慶 ，朱 鏡 ，梁偉波

（1.成都市公安局，四川 成都 610081；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

頭屑由角化程度不同的表皮細(xì)胞組成，常見(jiàn)于衣服肩、領(lǐng)部或帽子、頭套等內(nèi)側(cè)，是法醫(yī)日常檢案中能用EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器獲取的一類(lèi)特殊生物檢材。已有文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道可用頭屑提取DNA并獲得STR分型。EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器，是公安部物證鑒定中心研制的針對(duì)脫落細(xì)胞的提取裝置，利用膠帶直接粘取客體表面的脫落細(xì)胞，是現(xiàn)階段實(shí)踐中針對(duì)接觸性檢材DNA進(jìn)行提取的主要方法[4-5]。一般情況下常采用這種方法收集衣帽上的皮屑以達(dá)到富集的目的，再提取DNA進(jìn)行分型，但這種方法檢測(cè)獲得混合分型結(jié)果的概率較高[6]，為案件分析帶來(lái)了一定的困難[7]。如果能對(duì)單片狀頭屑進(jìn)行DNA提取并STR分型，可提高透明膠帶所富集樣本的利用率，為案件偵破提供更豐富的證據(jù)信息。

本研究采用透明膠帶和EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器粘取收集頭屑檢材，再分別用鏡下單片狀頭屑DNA提取分型法（簡(jiǎn)稱“單片頭屑分析法”）和EZ-tape法提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和STR分型，比較兩種方法的樣本檢出情況。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

EZ4體式顯微鏡、DM2000顯微鏡加裝DFC425 C照相機(jī)（日本Leica公司），無(wú)菌顯微鑷［上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠］，EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器（公安部物證鑒定中心），9700型PCR儀、3130xl基因分析儀（美國(guó)AB公司）。

Chelex-100（美國(guó) Sigma公司），蛋白酶 K（美國(guó)Roche公司），PowerPlex?21試劑盒（美國(guó) Promega公司）。

1.2 樣本采集

兩名志愿者輪流佩戴同一頂帽子各10次，每次5min。采用EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器和透明膠帶分別在帽子內(nèi)側(cè)進(jìn)行粘取取樣。

EZ-tape法：EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器共粘取24份樣本，其中12份在56℃蛋白酶K消化時(shí)進(jìn)行持續(xù)振蕩，12份樣本靜置消化。消化時(shí)間均為1h。

單片頭屑分析法：體式顯微鏡下觀察透明膠帶粘取的樣本，選取單片狀頭屑進(jìn)行取樣，其中24份樣本在56℃蛋白酶K消化時(shí)進(jìn)行持續(xù)振蕩，并按頭屑直徑分為≤200 μm、>200～500 μm、>500 μm 三個(gè)亞組，每組8份樣本。另在鏡下隨機(jī)選取24片頭屑行靜置消化處理。消化時(shí)間均為1h。

取該兩名志愿者的口腔拭子作陽(yáng)性對(duì)照。

本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)條款規(guī)定。

1.3 STR分型

樣本均用Chelex-100法提取DNA，EZ-tape法體系內(nèi)Chelex-100和蛋白酶K分別為65、5μL，單片頭屑分析法體系內(nèi)Chelex-100和蛋白酶K分別為27、3μL。使用 PowerPlex?21試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，10μL終體系中包含4μL DNA模板，毛細(xì)管電泳獲得STR分型。按照PowerPlex?21試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置擴(kuò)增及電泳條件。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)不同分組樣本獲得準(zhǔn)確分型的樣本數(shù)進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡觀察

取透明膠帶放置于顯微鏡下觀察可見(jiàn)：?jiǎn)纹瑺铑^屑、多片重疊成塊狀頭屑及衣物纖維等散在分布于鏡下視野中。同一放大倍數(shù)下，三組單片狀頭屑大小示例見(jiàn)圖1。

圖1 三組單片狀頭屑大小示例

2.2 樣本分型結(jié)果

2.2.1 EZ-tape法分型結(jié)果

EZ-tape法所獲24份檢材分型結(jié)果與兩份陽(yáng)性對(duì)照比對(duì)：11份樣本發(fā)生漏檢，獲得了單一來(lái)源的分型結(jié)果（45.8%），10份獲得混合分型結(jié)果（41.7%），2份樣本未檢出（8.3%），1份樣本僅3個(gè)基因座檢出等位基因（4.2%），詳見(jiàn)表1。11份獲得單一來(lái)源分型結(jié)果的樣本中，3份與志愿者1分型結(jié)果一致，8份與志愿者2一致。10份獲得混合分型結(jié)果的樣本中，4份包含兩份陽(yáng)性對(duì)照的全部相應(yīng)等位基因，2份有部分基因座發(fā)生等位基因插入（圖2），4份有部分基因座發(fā)生等位基因丟失，詳見(jiàn)表2。

表1 EZ-tape法獲得分型結(jié)果 （份）

圖2 EZ-tape法獲得混合分型且部分等位基因發(fā)生等位基因插入

表2 EZ-tape法獲得的混合分型結(jié)果 （份）

2.2.2 單片頭屑分析法分型結(jié)果

48份單片狀頭屑分型圖譜與兩份陽(yáng)性對(duì)照比對(duì)后獲得的結(jié)果見(jiàn)表3。檢測(cè)到完整分型的振蕩樣本數(shù)為11份，靜置消化的為1份；未檢出的振蕩樣本數(shù)為4份，靜置消化為11份；發(fā)生等位基因插入或丟失的振蕩樣本數(shù)為9份，靜置消化的為12份。振蕩與靜置消化處理后的分型準(zhǔn)確數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而振蕩處理的三個(gè)亞組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 單片狀頭屑分型結(jié)果 （份）

48份樣本中有36份未能獲得完整分型，12份獲得了完整分型，其中與志愿者1分型結(jié)果相同的為8份，與志愿者2分型結(jié)果相同的為4份。48份樣本中有20份獲得了7個(gè)以上基因座分型結(jié)果，10份在志愿者1的分型中找到，10份在志愿者2的分型中找到；28份獲得少于7個(gè)基因座的分型而難以判斷樣本個(gè)體來(lái)源。48份樣本中有2份獲得混合分型結(jié)果，1份在Penta E和D21S11基因座上出現(xiàn)超過(guò)2個(gè)等位基因，另1份在CSF1PO基因座上獲得志愿者1、志愿者2的混合分型結(jié)果。

3 討 論

頭屑由角化程度不同的表皮細(xì)胞組成，是日常檢案采集樣本時(shí)常能獲取的一類(lèi)特殊檢材。LORENTE等[1-3]的研究表明：利用頭屑提取DNA并獲得STR分型具有可行性，作為一種特殊類(lèi)型的法醫(yī)物證學(xué)檢材，頭屑具有較高的研究?jī)r(jià)值。本研究采用直接分析檢測(cè)顯微鏡下獲取的單片狀頭屑的方法，同時(shí)與常規(guī)EZ-tape法進(jìn)行比較。用透明膠帶富集頭屑后，借助體式顯微鏡選取單片狀頭屑提取DNA，能夠提高檢材利用率并盡量減少形成混合分型。EZ-tape法檢測(cè)中有10份（41.7%）獲得了混合分型結(jié)果，其中6份有部分基因座出現(xiàn)等位基因插入或丟失的情況。與之相比，單片頭屑分析法中48份樣本的分型結(jié)果中：有20份樣本獲得了7個(gè)以上便于判斷樣本來(lái)源的基因座分型，其中1份樣本的1個(gè)基因座檢出兩名志愿者的混合分型且無(wú)基因座檢出超過(guò)2個(gè)等位基因；28份樣本獲得少于7個(gè)基因座的分型而難以判斷樣本個(gè)體來(lái)源，其中1份樣本在2個(gè)基因座上檢出超過(guò)2個(gè)等位基因。對(duì)比可見(jiàn)，單片頭屑分析法檢出混合分型的比例低于常規(guī)EZ-tape法，提示單片頭屑分析法更利于獲得單個(gè)個(gè)體來(lái)源的STR分型結(jié)果。此外，常規(guī)EZ-tape法與單片頭屑分析法均檢見(jiàn)等位基因插入或丟失，而發(fā)生等位基因插入或丟失的混合分型結(jié)果會(huì)增加結(jié)果分析的難度（圖2）。EZ-tape法檢測(cè)的樣本中有11份（45.8%）發(fā)生漏檢，僅獲得單一來(lái)源分型結(jié)果。1份樣本用傳統(tǒng)EZ-tape方法僅能進(jìn)行一次DNA提取及STR分型實(shí)驗(yàn)，發(fā)生DNA來(lái)源未完全檢出的可能性大，而在實(shí)際案件中，DNA檢驗(yàn)人員是根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)人員提供的EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器獲得的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，得出DNA報(bào)告為刑偵人員提供案件線索，未完全檢出DNA來(lái)源數(shù)量可能導(dǎo)致案件偵查方向錯(cuò)誤或嫌疑人“漏網(wǎng)”，比較之下，單片頭屑分析法雖增加了工作量，卻可減少漏檢的概率，可為刑偵人員提供更多、更準(zhǔn)確的線索。

單片狀頭屑屬于一個(gè)個(gè)體，理論上僅能檢出單一個(gè)體來(lái)源的DNA分型，本研究中單片狀頭屑仍檢出混合分型，推測(cè)其原因可能在于志愿者在多次輪流戴帽的過(guò)程中游離DNA附著在頭屑表面。后續(xù)研究可對(duì)頭屑表面是否存留游離DNA及其對(duì)分型結(jié)果的影響進(jìn)行深入探討。

頭屑僅含微量有核細(xì)胞，可提供的DNA量十分有限。而低拷貝模板樣本分型結(jié)果最主要的缺陷是在擴(kuò)增過(guò)程中發(fā)生隨機(jī)變異，易產(chǎn)生隨機(jī)污染[8]，因此，如何有效地從樣本中獲得更多的DNA以提高DNA提取效率，對(duì)提高分型成功率十分關(guān)鍵。本研究嘗試探索了蛋白酶K消化過(guò)程中樣本振蕩情況與DNA提取效率之間的關(guān)系。在單片頭屑分析法中，振蕩獲得的11個(gè)樣本的完整分型而靜置消化僅獲得1個(gè)樣本的完整分型，二者在分型準(zhǔn)確率上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢钥闯鲈贒NA提取過(guò)程中是否振蕩會(huì)影響最終的分型結(jié)果。推測(cè)在蛋白酶K消化過(guò)程中對(duì)樣本進(jìn)行振蕩能更加充分地消化未完全角化的有核細(xì)胞，從而釋放更多的DNA，最終提高STR分型準(zhǔn)確率。

單片頭屑分析法中振蕩的3個(gè)亞組之間，獲得準(zhǔn)確分型的基因座數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，未觀察到頭屑大小對(duì)STR分型準(zhǔn)確率存在明顯影響，提示頭屑大小與其包含未角化有核細(xì)胞的數(shù)目之間可能不存在線性關(guān)系，具體還需要擴(kuò)大樣本量后進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果提示，直接分析檢測(cè)顯微鏡獲取的單片狀頭屑在降低混合樣本檢出率和提高個(gè)體檢出率方面有一定的優(yōu)勢(shì)。在采用Chelex-100法提取DNA時(shí)，蛋白酶K消化過(guò)程中對(duì)樣本進(jìn)行振蕩可提高分型準(zhǔn)確率。而頭屑大小與其含有的DNA量是否呈線性關(guān)系及其與STR分型成功率的關(guān)系還需在今后的研究中進(jìn)一步探索。