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      實(shí)驗(yàn)用西藏小型豬CYP3A46基因擴(kuò)增梯度PCR方法的建立

      2018-10-09 07:41:40盧康榮白靜張嘉寧謝水林顧為望黃黎珍王萬(wàn)山
      科技視界 2018年19期
      關(guān)鍵詞:克隆

      盧康榮 白靜 張嘉寧 謝水林 顧為望 黃黎珍 王萬(wàn)山

      【摘 要】目的:建立西藏小型豬CYP3A基因梯度PCR擴(kuò)增方法。方法:以西藏小型豬肝臟總cDNA為模板,基于CYP3A46基因引物,對(duì)CYP3A46進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增(設(shè)計(jì)溫度梯度55-65℃)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,獲得特異性好的最佳退火溫度。結(jié)果:各退火溫度均能特異的擴(kuò)增出1500bp左右的目的條帶。結(jié)論:本反應(yīng)體系及各溫度梯度均可特異性擴(kuò)增西藏小型豬CYP3A46基因,為進(jìn)一步克隆表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

      【關(guān)鍵詞】細(xì)胞色素P450酶;西藏小型豬;克隆

      中圖分類(lèi)號(hào): Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 2095-2457(2018)19-0088-002

      DOI:10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.19.039

      Establishment of gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of laboratory Tibet minipigs

      LU Kang-rong1 BAI Jing2 ZHANG Jia-ning3 XIE Shui-lin2 GU Wei-wang3 HUANGLi-zhen2 WANG Wan-shan3*

      (1.Basic Medical College of Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China;2.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou Guangdong 510006, China;3.Laboratory Animal Service Center, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)

      【Abstract】Objective: Establishing gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of Tibet minipigs. Methods: Based on CYP3A46 primers, using total cDNA of Tibet minipig liver as template, CYP3A46 was amplified by gradient PCR, temperature gradients were set as 55-65℃. PCR fragments was checked by DNA agarose gel electrophoresis, trying to get the best annealing temperature. Results: A specific band of 1500 bp corresponding to the target band could be amplified by any temperature from 55 to 65℃. Conclusions: CYP3A46 gene of Tibet minipigs could be specifically amplified by this reaction system and temperature gradients, laying a foundation for the further cloning and expression.

      【Key words】Cytochrome P450 enzyme;Tibet minipig;Clone

      由于與人在解剖、生理生化等方面有極大相似性,小型豬在人類(lèi)疾病動(dòng)物模型、器官移植、新藥研發(fā)等領(lǐng)域的研究日益廣泛,已成為除靈長(zhǎng)類(lèi)和犬以外唯一被FDA推薦的臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1-2]。小型豬是人類(lèi)藥物代謝(尤其是CYP3A途徑代謝類(lèi)藥物)的重要模型動(dòng)物,但其細(xì)胞色素 P450 的研究大大落后于人及大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。國(guó)外的研究主要集中在 Goettingen和Yucantan小型豬上,國(guó)內(nèi)對(duì)小型豬細(xì)胞色素 P450 的研究?jī)H在巴馬小型豬和貴州小型豬有少量報(bào)道[3-4]。實(shí)驗(yàn)用西藏小型豬已在生物醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,但是關(guān)于其P450酶系研究尚屬空白[5],本研究擬建立西藏小型豬CYP3A46基因梯度PCR擴(kuò)增技術(shù)方法,為進(jìn)一步的克隆表達(dá)研究打下基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      6月齡成年西藏小型豬肝臟組織置液氮中保存,Trizol總RNA抽提試劑(GIBCO), PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司;DNA Marker購(gòu)于天根公司;其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或常規(guī)生化試劑。

      1.2 方法

      1.2.1 引物設(shè)計(jì)

      根據(jù)Genebank中基因序列CYP3A46(NM_001134824),設(shè)計(jì)合成正向引物Scyp3a46-F:5'gtggc catgg acctg atccc3';反向引物Scyp3a46-R:5'aagtc aggct ccact tgtgg3'。引物送英駿生物技術(shù)有限公司合成。

      1.2.2 西藏小型豬肝臟總cDNA的制備

      TRIZOL 法提總RNA。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒,按說(shuō)明書(shū)操作規(guī)程進(jìn)行西藏小型豬肝臟總cDNA的制備。

      1.2.3 西藏小型豬CYP3A46基因編碼序列的梯度PCR擴(kuò)增

      應(yīng)用梯度PCR進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化:反應(yīng)體系如下:

      反應(yīng)程序:預(yù)變性98℃ 5min;98℃ 10s,52-62℃ 15s,72℃ 20s;30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,最后4℃保存。

      1.2.4 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及片段膠回收

      將5μL DNA MarkerⅢ、PCR產(chǎn)物和5μL6×Loading Buffer全部置于1%瓊脂糖凝膠,200V恒壓電泳20min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,紫外激發(fā)光下觀察片段大小。

      2 結(jié)果

      選擇引物CYP3AF和CYP3A46R,對(duì)CYP3A46進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增(設(shè)計(jì)溫度梯度55-65℃),以期找出最佳擴(kuò)增條件。結(jié)果見(jiàn)圖1,表明各退火溫度均能特異的擴(kuò)增出1500bp左右的目的條帶。

      3 討論

      藥物在豬體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化與人極為相似,是非臨床安全性評(píng)價(jià)的良好模型。加之小型豬飼養(yǎng)成本低,操作簡(jiǎn)便,因此小型豬應(yīng)用于新藥開(kāi)發(fā)研究已成為國(guó)際范圍內(nèi)的焦點(diǎn)。國(guó)外小型豬資源匱乏,我國(guó)小型豬品種資源豐富[6]。但是國(guó)外尤其是歐洲的G?觟ttingen小型豬已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用,尤其是藥理、毒理等新藥研發(fā)領(lǐng)域[7]。我國(guó)小型豬資源開(kāi)發(fā)水平與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家比較仍有較大差距。西藏小型豬是從西藏引進(jìn),在廣州地區(qū)進(jìn)行風(fēng)土馴化及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的小型豬豬種,該小型豬具備抗疾病能力強(qiáng)、應(yīng)激反應(yīng)小、術(shù)后愈合快等優(yōu)點(diǎn),是非常有特色的實(shí)驗(yàn)小型豬[8]。

      I相藥物代謝酶-細(xì)胞色素P450酶系(CYPs)在眾多外來(lái)化合物(包括藥物)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中扮演了重要角色, 據(jù)估計(jì)60%普通處方藥需要通過(guò)細(xì)胞色素P450系統(tǒng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,催化的底物廣泛,是人體內(nèi)最主要的代謝酶,在藥理學(xué)、毒理學(xué)研究中有著重要的意義[9]。有研究表明小型豬1A、2E、3A、4A等具體亞型可作為藥物代謝模型。小型豬與人CYP3A的序列同源性較高,關(guān)于其亞族中的CYP3A29研究最多,該酶為人CYP3A4在豬體內(nèi)的同源酶。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于小型豬各亞型CYP酶的藥物代謝特征報(bào)道甚少[10]。國(guó)內(nèi)有報(bào)道貴州小型香豬肝微粒體CYP酶主要亞型的反應(yīng)活性,與人肝微粒體的活性相近,并呈現(xiàn)出與人相應(yīng)酶特異性抑制劑的抑制反應(yīng)活性[11]。楊家大等報(bào)道巴馬小型豬、貴州小型香豬肝臟CYP3A29 mRNA表達(dá)水平與人CYP3A4相近[12]。

      鑒于關(guān)于西藏小型豬的CYP酶特性研究目前尚屬空白,為了克隆西藏小型豬相關(guān)CYP基因進(jìn)行深入研究,本實(shí)驗(yàn)基于梯度PCR技術(shù),摸索PCR擴(kuò)增西藏小型豬CYP3A46的最佳退火溫度和反應(yīng)條件。研究結(jié)果表明,55-65℃范圍內(nèi)的各退火溫度均能特異的擴(kuò)增出1500bp左右的目的條帶,各溫蒂條件下擴(kuò)增效果類(lèi)似,說(shuō)明該反應(yīng)體系和退火溫度條件適于進(jìn)行西藏小型豬CYP3A基因的克隆擴(kuò)增,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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