盧克歡 劉 興 楊 怡 廖志華 吳能表,*

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UV-B脅迫下Ca2+對顛茄生理特性與次生代謝產物的調控研究

盧克歡1劉 興1楊 怡1廖志華2吳能表1,*

1西南大學生命科學學院/ 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 重慶 400715;2西南大學生命科學學院, 重慶 400715

有害中波紫外線(Ultraviolet B, UV-B; 280~320 nm)輻射影響植物的生長和發(fā)育, Ca2+是植物生長發(fā)育所必須的大量元素之一, 外源Ca2+不但可以提高植物抗脅迫能力, 還對次生代謝具有調控作用。以顛茄(L.)實生苗為材料, 在UV-B輻射(10 μW cm–2)背景下, 研究不同濃度外源Ca2+、不同處理時間對顛茄生理特性、氮代謝、次生代謝產物含量以及托品烷類生物堿代謝途徑中3個關鍵酶基因表達量的影響。結果表明, 隨著UV-B輻射時間的延長(4 ~12 d), 對顛茄的光合作用、氮代謝以及生物堿的積累產生抑制作用, 加劇了膜脂氧化程度; 經外源Ca2+處理, 葉片初始熒光(o)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量呈下降趨勢, 葉片最大光化學效率(vm)、光合色素(總葉綠素、類胡蘿卜素)含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均呈上升趨勢, 說明Ca2+有利于緩解UV-B輻射的抑制, 加強對UV-B脅迫的抗性; 在Ca2+處理下, 葉片中硝態(tài)氮含量顯著降低, 游離氨基酸、可溶性蛋白含量和氮代謝關鍵酶(NR、GS、GDH)的活性顯著提高, 葉片中莨菪堿含量和東莨菪堿含量顯著提高; qRT-PCR分析顯示, 在外源Ca2+的誘導下, 托品烷類生物堿合成途徑中3個關鍵酶基因(、、)表達量均有不同程度上調趨勢。本研究結果可為田間種植提供理論參考。

UV-B脅迫; 顛茄; 生理特性; 氮代謝; 托品烷類生物堿

顛茄(L.), 茄科顛茄屬, 多年生草本植物, 全草可入藥, 是我國藥典規(guī)定的托品烷類生物堿(tropane alkaloids, TAs)藥源植物[1]。TAs包括莨菪堿和東莨菪堿, 是一類重要的抗膽堿藥物, 提取自茄科植物的次生代謝產物, 具有多方面的藥用價值, 廣泛用于麻醉、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘、抗暈動病, 也可用于控制帕金森病的僵直和震顫[2-3]。顛茄中的TAs含量極低, 有著較高的藥用價值, 且市場需求量巨大。顛茄作為托品烷類生物堿的重要藥源植物, 如何提高其次生代謝產物莨菪堿和東莨菪堿的合成具有十分重要的醫(yī)藥應用價值。

地球的大氣臭氧層是抵抗紫外輻射的保護層, 它能夠有效吸收強烈的太陽光帶來的紫外線輻射, 保護地球上的生物免受傷害。隨著工業(yè)化發(fā)展的進程, 氟氯烷烴和氮氧化物的大量排放, 導致地球臭氧層變薄甚至出現(xiàn)空洞, 到達地表的有害中波紫外線逐漸增強, 對植物的生長極為不利[4-5]。UV-B不僅作為一種環(huán)境脅迫導致植物DNA損傷、細胞分裂停滯、細胞死亡以及生長受抑制, 也能夠調控植物形態(tài)建成與營養(yǎng)生長, 同時影響包括類黃酮、單寧等多種次生代謝物合成。

鈣是植物體內不可或缺的礦物質元素, 同時也是維持植物細胞正常生長代謝的重要離子, 作為偶聯(lián)細胞外信號的第二信使, 在維持細胞膜結構及細胞膜結合蛋白穩(wěn)定性、調控多種酶活性方面都具有重要作用[6-7]。Ca2+和鈣調素參與脅迫信號的感受、傳遞、響應與表達等過程, 以增強植物抗逆性[8]。Ca2+在逆境條件下可以保持植物細胞壁、細胞膜的穩(wěn)定性[9], 激活或抑制細胞內特定酶的活性, 調節(jié)逆境中植物體內的生理生化反應[10-11]。外施Ca2+可以增強鹽脅迫下唐古特白刺氮代謝中關鍵酶的活性,促進對無機氮源的吸收, 保護氮代謝途徑不受鹽脅迫的破壞[12]; 在干旱脅迫下, Ca2+可以促進黃瓜幼苗的生長, 提高葉片的葉綠素的含量、凈光合速率、蒸騰速率以及水分利用率, 降低膜脂過氧化程度及脯氨酸和可溶性蛋白的積累量, 緩解干旱對黃瓜幼苗的不利影響, 從而增強植株對干旱脅迫的抗性[13]; 適宜濃度的外源Ca2+能明顯改善低溫脅迫對玉米幼苗生長的抑制作用, 提高玉米幼苗在低溫脅迫下的適應能力[14]。此外, 外源Ca2+對植物的次生代謝也起著顯著作用, 外源Ca2+可以影響水蓼細胞中黃烷醇[15]、曼陀羅細胞中莨菪堿[16]、田七細胞中人參皂苷Rb1[17]和咖啡細胞中生物堿[18]等次生代謝物的生物合成與積累。Ca2+對于提高植物逆境適應性及次生代謝調控具有重要的生理作用, 其是否參與調控顛茄在UV-B脅迫條件下的逆境適應性和次生代謝產物的合成還有待探究。本試驗旨在探究UV-B脅迫條件下, 外源Ca2+對顛茄光合及耐逆生理特性、次生代謝產物積累方面的功能, 對于提高顛茄次生代謝產物托品烷類生物堿的合成具有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

顛茄(L.)種子購自湖南芝茵農業(yè)開發(fā)有限責任公司, 并經西南大學生命科學學院吳能表教授鑒定。

挑選顆粒飽滿的顛茄種子, 充分浸潤后置濕潤濾紙上, 待萌發(fā)后移栽至盛有混勻介質(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石= 3∶1∶1)的營養(yǎng)盆(12 cm×13 cm)中, 每盆3株, 共300盆, 于25°C溫室內培養(yǎng), 每7 d澆灌一次稀釋10倍的MS營養(yǎng)液, 2個月后, 挑選200盆長勢一致的顛茄幼苗, 開始試驗處理。以顛茄葉片中MDA含量和抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的變化為參考標準, 經預實驗確定UV-B脅迫所用的輻照強度為10 μW cm–2, 參照楊衛(wèi)星等[19]研究中的處理濃度并結合預實驗結果, 選取5個CaCl2溶液梯度濃度, 每天12:00—12:40進行相同強度的UV-B照射, 同時以CaCl2噴施葉片至溶液欲滴, 處理方式見表1。

分別在第4、第8和第12天采集顛茄葉片, 存放于-80°C冰箱, 用于各項指標的測定。另采集顛茄根、葉組織材料, 一部分凍存于液氮中, 用于基因表達量的測定; 另一部分于70°C烘箱中烘干, 用于生物堿含量的測定。設置每處理組3次重復。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素熒光動力學參數(shù)o和vm的測定

將顛茄植株暗處理2 h, 選擇長勢一致且較為平展的葉片(避開主葉脈)用葉綠素熒光儀PAM-2100 (WALZ, 德國)測定初始熒光(o)和最大光化學效率(vm), 取3次數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.2 光合色素與MDA含量的測定 參照張憲政[20]的方法, 稱取0.2 g新鮮的顛茄葉片, 去中脈, 剪成細絲狀, 置黑暗條件下浸泡于20 mL丙酮-乙醇混合液(1∶1) 72 h至白色。取上清液3 mL于石英比色皿中, 測吸光值663、645和470, 計算葉綠素含量和類胡蘿卜素含量。參照Velikova等[21]的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測定MDA含量。

表1 顛茄幼苗的處理組合

1.2.3 抗氧化酶活性的測定 參照Giannopolitis和Ries[22]的方法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性, 通過觀察NBT的光還原抑制程度, 將能夠抑制反應酶量的50%定義為1個SOD活力單位(U); 采用愈創(chuàng)木酚法[23]測定過氧化物酶(peroxide, POD)活性, 將每分鐘470值升高0.01定義為1個酶活力單位(U); 參照高俊鳳[24]的方法測定過氧化氫酶(catalase, CAT)活性, 將每分鐘240下降0.1定為一個酶活力單位(U)。

1.2.4 硝態(tài)氮、游離氨基酸和可溶性蛋白含量的測定 參照高俊鳳[24]的方法測定硝態(tài)氮含量。NO3–與水楊酸生成硝基水楊酸, 在堿性條件下(pH > 12)呈黃色, 檢測410值反映硝態(tài)氮的含量; 參照李合生[25]的茚三酮溶液顯色法測定游離氨基酸含量; 參照高俊鳳[24]的考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量。

1.2.5 GS、NR和GDH活性的測定 采用湯紹虎等[26]的方法測定谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性。在ATP和Mg2+存在下, GS催化植物體內谷氨酸形成谷氨酰胺, 谷氨酰胺轉化為γ-谷氨?；惲u肟酸, 進而在酸性條件下與鐵形成紅色絡合物, 在540 nm處有最大吸收峰, 即以γ-谷氨?；惲u肟酸與鐵絡合物的生成量來表示GS酶活性; 采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒分別測定硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)活性與谷氨酸脫氫酶(glutamic dehydrogenation enzyme, GDH)活性。

1.2.6 莨菪堿與東莨菪堿的提取與測定 參照Zárate等[27]的方法, 略有改動, 提取顛茄葉片中莨菪堿和東莨菪堿; 用HPLC測定其含量, 色譜儀為日本島津(Shimadzu) LC-60A高效液相色譜儀(泵: LC-20AD, 控制器: SPD-20A, 柱溫箱: CTO-10AS vp); 色譜柱為Ultimate XB-C18液相色譜柱(5 μm, 4.6 mm×250.0 mm); 流動相為甲醇∶醋酸緩沖液(20 mmol L–1醋酸銨, 0.1%甲酸, pH 4.0) = 1∶4; 檢測波長226 nm; 流速1.0 mL min–1; 柱溫40°C; 進樣量10 μL。

1.2.7 總RNA的提取及cDNA的合成 按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒使用說明提取總RNA。按照TIANGENFastQuant RT Kit (with gDNase)說明書操作步驟進行顛茄根、葉RNA的反轉錄, gDNA去除反應體系10 μL, 分別為5×gDNA buffer 2 μL, 17.5 ng μL–1Total RNA 8 μL, 反應條件為42°C孵育3 min, 冰浴暫存; 反轉錄反應體系10 μL, 分別為10×Fast RT buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O 5 μL; 將10 μL反轉錄反應體系加入到去基因組DNA污染的Total RNA, 反應條件為42°C 15 min, 95°C 3 min, 冰浴5 min, 獲得cDNA。

1.2.8 引物設計與qRT-PCR、、和基因引物根據(jù)NCBI上公布的序列設計及參照強瑋等[28-29]的引物序列, 由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成(表2)。采用Promega GoqPCR Master Mix試劑盒使用說明檢測, 反應體系20 μL, 分別為GoqPCR Master Mix 10.0 μL、各基因上游引物 (10 μmol L–1) 0.4 μL、各基因下游引物(10 μmol L–1) 0.4 μL、cDNA模板2.0 μL、ddH2O 7.2 μL。反應條件為Stage 1 預變性, 95°C 10 min; Stage 2擴增循環(huán), 95°C 15 s, 60°C 1 min, 共40循環(huán); Stage 3溶解曲線, 95°C 5 s, 60°C 15 s, 95°C 15 s。依制造商的操作說明在Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad, USA)上完成, 以為內參基因, 實驗數(shù)據(jù)采用Pfaffl Method法計算得出結果。

表2 熒光定量PCR所需引物

2 結果與分析

2.1 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄葉片F(xiàn)o和Fv/Fm的影響

葉綠素熒光參數(shù)可以較為靈敏地反映光合作用的變化情況, 被稱為研究植物光合功能的快速、無損傷探針[30]。初始熒光o表示PS II反應中心處于完全開放時的熒光產量。在UV-B脅迫下, 在各處理時間段內, T1組比T0組的o顯著升高, 并隨著處理時間的增加逐漸增大; 噴施不同濃度Ca2+處理后, 不同處理組較T1有不同程度的回落現(xiàn)象, 且當處理時間為12 d、濃度為6 mmol L–1時緩解效果最為顯著(圖1-A)。

v/m代表PS II的最大光化學效率, 是較為常用的葉綠素熒光指標之一, 此指標在脅迫條件下通常會降低[31], 同時也可以表明PS II遭受到破壞[32]。在UV-B脅迫下, T1處理組的v/m相對T0組顯著降低, 隨著處理時間的延長, T1處理組的vm呈下降趨勢, 經不同濃度Ca2+處理后, 在各時間段均呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢, 在處理第12天中, 當Ca2+濃度為4 mmol L–1時, 與T1相比大幅提高, 緩解效果最顯著(圖1-B)。

圖1 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄初始熒光(A)和最大光化學效率(B)的影響

不同小寫字母表示相同處理時間不同濃度Ca2+處理間差異顯著(<0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0 mmol L–1、2 mmol L–1、4 mmol L–1、6 mmol L–1和8 mmol L–1。T0表示未進行任何處理, 即空白對照組。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca2+concentration in the same treating days at the 0.05 level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.2 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄葉片中光合色素含量的影響

在植物葉片中, 葉綠素含量與類胡蘿卜素含量是表征植物體光合能力的重要指標。由圖2可知, T1組隨著UV-B處理時間的延長, 顛茄葉片中的葉綠素含量與類胡蘿卜素含量逐漸降低; 在各處理時間段內, T1組的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量比T0對照組顯著降低, 經過噴施不同濃度Ca2+溶液處理后, 二者均有不同程度的上升趨勢。當Ca2+溶液濃度為6 mmol L–1時效果最顯著, 如在處理12 d時, T4組相比T1組, 總葉綠素含量與類胡蘿卜素含量分別提高了64.8%和56.1%。說明適宜濃度的外源Ca2+有助于促進葉綠素和類胡蘿卜素的合成, 有效緩解UV-B輻射對光合膜的破壞, 從而有利于顛茄在UV-B迫下增強其光合能力。

圖2 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄葉片中總葉綠素含量(A)與類胡蘿卜素含量(B)的影響

不同小寫字母表示相同處理時間不同濃度Ca2+處理間差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進行任何處理, 即空白對照組。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca2+concentration in the same treating days at the 0.05 probability level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.3 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄抗氧化酶活性和MDA含量的影響

植物體中抗氧化酶活性的變化在一定程度上可反映出植物體抗逆性的強弱[33]。對于T1處理組, SOD和POD活性的變化基本一致, 均隨UV-B處理時間的增加呈先升后降趨勢(圖3-A, B)。CAT的活性在T1處理下, 隨處理時間的延長持續(xù)下降(圖3-C)。UV-B處理的第8天和第12天, T1組中SOD、POD和CAT三種酶的活性比T0對照組均顯著降低, 說明UV-B輻射對顛茄的抗氧化系統(tǒng)產生了脅迫效應, 且隨著處理時間的增加其脅迫效應愈加嚴重。在不同濃度Ca2+處理下, 3種抗氧化酶的活性均有不同程度提高, 在各處理時間范圍內, 當Ca2+濃度為4 mmol L–1和6 mmol L–1時緩解效果較為顯著。

MDA是膜脂過氧化的產物, 可以作為衡量植物膜脂過氧化的程度。在UV-B輻射處理下, MDA含量比T0對照組大幅升高, 且隨著UV-B處理時間的延長呈逐漸升高趨勢。在UV-B輻射背景下, 經不同濃度外源Ca2+處理后發(fā)現(xiàn), 在3個不同的處理時間段內, MDA含量均顯著降低。表明外源Ca2+可緩解UV-B輻射對顛茄膜系統(tǒng)的損害程度。其中, 在處理12 d, T4組MDA含量比T1組降低了52.2%, 緩解效果最顯著(圖3-D)。

2.4 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄氮代謝的影響

硝態(tài)氮是能夠被植物根部直接吸收的氮源, 植物吸收的無機氮源經一系列的還原與同化作用后形成游離氨基酸、可溶性蛋白等有機含氮化合物[34], 它們的含量是氮代謝的重要指標, 直接反映氮代謝的基本進程。由表3可知, 隨著UV-B處理時間的延長, T1處理組硝態(tài)氮含量逐漸增加, 經噴施Ca2+溶液后, 各處理組的硝態(tài)氮含量隨著處理時間的增加呈先降低后升高的趨勢, 同時在相同處理時間下, 其含量也隨著Ca2+濃度的升高而降低。在UV-B輻射下, T1組游離氨基酸含量和可溶性蛋白含量比T0組顯著降低, 且隨著UV-B處理時間的延長, 游離氨基酸含量逐漸降低, 可溶性蛋白含量在處理第4天有所升高, 隨后開始持續(xù)降低, 經不同濃度Ca2+處理后, 對于相同的處理時間, 兩者含量相對T1組升高顯著。表明UV-B輻射有利于顛茄葉片中硝態(tài)氮的積累, 但不利于對硝態(tài)氮的利用, 從而使游離氨基酸和可溶性蛋白等含氮化合物含量降低, 不利于氮代謝的進行。在Ca2+處理下, 加速了硝態(tài)氮的同化, 使游離氨基酸和可溶性蛋白含量顯著升高, 表明外源Ca2+可以有效緩解UV-B脅迫對氮代謝進程的抑制, 有利于氮代謝的進行。

在氮代謝途徑中, 硝酸還原酶(NR)是催化硝態(tài)氮轉化為NH4+-N的酶, 而NH4+-N與α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶(GDH)的催化下進一步形成Glu; 同時, 谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代謝過程中的另一個關鍵酶, 能催化NH4+-N和Glu合成谷氨酰胺, 對于高等植物同化NH4+-N具有重要的作用[35]。由表4可知, UV-B輻射處理使葉片中NR、GS和GDH酶活性顯著降低。T1處理組中, 在UV-B脅迫下NR和GS活性隨著處理時間的延長逐漸降低, 而GDH則是先增大后減小的趨勢。經過不同濃度的Ca2+處理后, 相同處理時間內, 3個關鍵酶的活性均有不同程度的升高趨勢。對于NR和GS, 當Ca2+濃度為6 mmol L–1時效果最顯著, 對于GDH則是4 mmol L–1效果最佳。以上結果表明, 短期UV-B輻射可以激活GDH活性的增大, 但是總體來看, UV-B輻射抑制了NR、GS和GDH的活性, 不利于顛茄氮代謝的進行。在適宜濃度外源Ca2+處理下, 可顯著提高3種關鍵酶的活性, 緩解UV-B脅迫對顛茄氮代謝關鍵酶活性的抑制作用, 從而加速顛茄對無機氮源的同化作用。

圖3 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄抗氧化酶活性(A, B, C)、丙二醛含量(D)的影響

不同小寫字母表示相同處理時間不同濃度Ca2+處理間差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8。T0表示未進行任何處理, 即空白對照組。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca2+concentration in the same treating days at the 0.05 probability level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

表3 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄硝態(tài)氮、游離氨基酸和可溶性蛋白含量的影響

(續(xù)表3)

表中同一列數(shù)據(jù)上標以不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進行任何處理, 即空白對照組。

Figures followed by different letters in each column are significantly different (< 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2 , 4 , 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

表4 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶活性的影響

表中同一列數(shù)據(jù)上標以不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進行任何處理, 即空白對照組。

Figures followed by different letters in each column are significantly different (< 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.5 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄葉片中托品烷類生物堿含量的影響

莨菪堿和東莨菪堿是托品烷類生物堿最主要的兩種生物堿, 也是藥用價值最高的兩種成分。由表5可知, 在UV-B輻射處理第8天和第12天時, 顛茄葉片中莨菪堿和東莨菪堿含量相比T0對照組均顯著降低, T1處理組中, 隨著UV-B處理時間的增加, 莨菪堿的含量先升高后降低, 東莨菪堿含量則是持續(xù)降低, 表明短期UV-B輻射可以促進莨菪堿的積累,但中長期輻射不利于托品烷類生物堿的積累。外施不同濃度Ca2+處理后, 在相同處理時間下, 莨菪堿與東莨菪堿的含量均比T1組有所提高, 隨著Ca2+濃度的升高呈先升后降的趨勢。處理12 d時, T4組的莨菪堿與東莨菪堿含量較T1組顯著提高, 分別提高了15.7%和31.9%。以上結果表明, 短期UV-B輻射可以促進莨菪堿的積累, 中長期輻射不利于托品烷類生物堿的積累, 總體而言, UV-B輻射不利于顛茄對莨菪堿與東莨菪堿的積累, 而適宜濃度的外源Ca2+可以有效緩解UV-B輻射對TAs積累的抑制。

表5 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄葉片莨菪堿和東莨菪堿含量的影響

表中同一列數(shù)據(jù)上標以不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進行任何處理, 即空白對照組。

Figures followed by different letters in each column are significantly different (< 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.6 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄根、葉中PMT、TR I、H6H相對表達量的影響

腐胺N-甲基轉移酶(putrescine N-methyltransferase, PMT)、托品酮還原酶Ι (tropinone reductase Ι, TR Ι)、莨菪堿-6-β-羥化酶(hyoscyamine-6-β-hydroxylase, H6H)是托品烷類生物堿合成途徑中的3個關鍵酶, 其相應編碼基因的表達量直接決定合成途徑的中間產物流向以及生物堿的產量[36]。以為內參基因, 采用qRT-PCR檢測了UV-B脅迫下處理12 d中T0組、T1組和T4組的顛茄根、葉中、和基因相對表達量。和在根中表達量較高,的表達量相對較低, 由T1組和T0組相比可知, 在UV-B處理12 d后,和的表達量均顯著降低, 而則有所升高, 但不顯著; 由T4組和T1組對比可知, 同樣在UV-B處理下, 經6 mmol L–1外源Ca2+處理后, 顯著促進了、和的表達(圖4-A)。在葉中幾乎不表達, 而明顯表達, 且表達水平較高; 在UV-B處理12 d后,的表達量較T0組有所升高但不顯著, 經6 mmol L–1外源Ca2+處理后, 顯著促進了的表達(圖4-B)。

圖4 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對顛茄根(A)、葉(B)中PMT、H6H、TR I相對基因表達量的影響

標以不同小寫字母的柱值在同一個基因不同處理組間差異顯著(< 0.05)。T0組表示未進行任何處理的空白對照, T1組表示UV-B輻射處理12 d, T4組表示UV-B輻射背景下外施6 mmol L–1Ca2+處理12 d。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments in the same gene at the 0.05 probability level. T0 group indicates untreated blank control groups; T1 group indicates UV-B radiation treatment for 12 days; T4 group indicates exogenous 6 mmol L–1Ca2+treatment for 12 days under UV-B stress.

3 討論

光合作用的強弱對植物的生長、產量以及抗逆性都具有十分重要的影響[37], 植物光合作用受到傷害的最初部位是與PS II緊密聯(lián)系的, 而逆境脅迫往往會導致葉綠體光合機構的破壞, 降低PS II原初光能轉換效率、抑制PS II潛在活性, 導致PS II功能下降[38]。本試驗結果顯示, UV-B輻射下, 相比T0對照組,o顯著升高,vm顯著降低, 且隨著UV-B輻射時間的延長, 初始熒光o逐漸增大, 最大光化學效率vm逐漸減小, 而在適宜濃度外源Ca2+處理下, 相比T1組,o顯著降低,vm明顯增大。表明顛茄在UV-B輻射條件下, 葉片中PS II反應中心受到傷害, 導致其原初能量轉換發(fā)生紊亂, 其葉綠素分子在吸收光能后, 激發(fā)態(tài)分子多以發(fā)出熒光的形式釋放能量, 而參與到光合作用的能量有所減少, 不利于光合作用的進行。在此基礎上, Ca2+可以有效地抵御UV-B對PS II反應中心的傷害, 緩解了葉片產生的光抑制, 可提高PS II的光能轉換效率, 使顛茄在UV-B脅迫下依然保持較高的光化學效率。這與秦舒浩等[39]提出的外源Ca2+有利于緩解高溫強光對西葫蘆幼苗葉片的光抑制和溫光破壞現(xiàn)象, 有效保護光合機構的觀點相一致。對光合作用而言, 葉綠素與類胡蘿卜素是參與光能吸收、傳遞和轉化的重要色素, 因此葉綠素含量會直接影響植物的生長。葉綠素含量的高低直接影響著光合速率和光合產物的形成, 類胡蘿卜素除吸收傳遞光能外, 還可起保護作用[40]。試驗結果顯示, UV-B脅迫下, 顛茄葉片中總葉綠素與類胡蘿卜素含量都顯著下降, 經不同濃度Ca2+處理下其含量有所上升。表明UV-B輻射加速了葉綠素和類胡蘿卜素的分解, 不利于顛茄進行正常的光合作用。而適當濃度的外源Ca2+有助于緩解UV-B輻射對葉綠體膜的破壞, 維持較高的光合色素含量, 保護葉綠體膜結構的完整性。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)是植物體內保護酶系統(tǒng)的主要成員, 是防御活性氧及其他自由基對細胞膜系統(tǒng)傷害的最重要的酶[41]。MDA是膜脂過氧化作用的主要產物之一, 其量的高低是膜脂過氧化強弱和質膜破壞程度的重要指標[42]。本試驗中, SOD和POD活性在UV-B脅迫下先升高后降低, CAT活性則是持續(xù)降低, 表明顛茄在UV-B照射初期可以通過自身調節(jié)SOD和POD活性的升高抵御逆境脅迫, 但隨著UV-B照射時間的推移, SOD、POD和CAT的活性均有所降低, 表明長時間UV-B輻射加劇了顛茄細胞的氧化程度, 不利于正常的生理活動。在外源Ca2+處理下, 相比同期處理下的T1組, 3種抗氧化酶的活性呈現(xiàn)出顯著升高趨勢。同時, 在UV-B脅迫下, 相比T0對照組, 膜脂過氧化主要產物MDA含量大幅上升, Ca2+處理后相比同期處理的T1組顯著降低, 且當Ca2+濃度為6 mmol L–1時最為顯著。以上結果表明, UV-B輻射會導致顛茄細胞膜脂過氧化程度增強, 膜透性增加, 加劇了氧化損傷; SOD、POD和CAT活性的顯著降低, 打破了在其共同作用下維持細胞內活性氧的代謝平衡, 無法及時清除體內的超氧自由基和H2O2等有害物質。而外源Ca2+則有助于刺激顛茄細胞產生更多的抗氧化酶或者提高抗氧化酶的活性, 從而降低活性氧水平, 抑制膜脂過氧化, 有利于提高顛茄在逆境條件下的抗性。這與邢建永等[43]提出的Ca2+能夠提高半夏類原球莖的抗氧化性, 提高其抗逆性的觀點相一致。

植物的次生代謝是以初生代謝為基礎, 初生代謝中氮代謝尤為重要。硝態(tài)氮是可被植物根系直接吸收的無機氮源, 經氮代謝途徑中相關酶的催化作用合成植物自身需要的含氮有機物, 如氨基酸和蛋白質等。本試驗結果表明, 在UV-B脅迫下, 隨著處理時間的延長, 顛茄葉片組織內的硝態(tài)氮含量逐漸增加, 游離氨基酸與可溶性蛋白含量逐漸降低。在外源Ca2+處理下, 游離氨基酸和可溶性蛋白含量顯著提高, 有效緩解了UV-B輻射對含氮有機物合成的抑制, 適宜濃度的Ca2+有助于提高UV-B脅迫下氮代謝關鍵酶的活性, 加速顛茄對硝態(tài)氮的同化, 從而提高自身含氮有機物的積累, 尤其是促進氨基酸的合成與轉化。這與高彥博[12]提出的外源Ca2+可以有效提高唐古特白刺氮代謝中關鍵酶的活性促進對硝態(tài)氮的利用的觀點相一致。同時, 通過促進氮代謝的進程, 有利于鳥氨酸和精氨酸的合成, 從而有利于生物堿的前體物質腐胺的積累。

莨菪堿和東莨菪堿是顛茄次生代謝的產物, 主要在根中合成, 存貯積累在地上部分的幼嫩組織中[28]。鈣鹽對半夏類原球莖總生物堿的合成具有顯著影響,適宜濃度的Ca2+提高半夏類原球莖有用次生代謝產物的量[19,43]。UV-B輻射可以誘導生物堿含量的增加, 溫泉等[44]研究發(fā)現(xiàn)隨著UV-B輻射時間的增加, 黃連中小檗堿含量逐漸增加。本試驗結果顯示, 在UV-B輻射處理下, 隨著輻射時間的增加, 顛茄葉片中東莨菪堿含量逐漸降低, 莨菪堿含量則是先增后降, 不利于總生物堿的積累。隨著Ca2+濃度的增加, 相同處理時間下莨菪堿與東莨菪堿的含量先增后降,當Ca2+濃度為4 mmol L–1和6 mmol L–1時效果較為顯著。以為內參基因, 經qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),和在根中均有表達, 在葉片中只有表達,和幾乎不表達。這與強瑋等[28-29]提出的、、均只在顛茄根中大量表達,在成熟葉片中強烈表達, 其次在花苞和根中少量表達的觀點相似。除此之外, 結果顯示, UV-B輻射抑制了和的表達水平, 卻可以促進的表達, 但不顯著; 而外源Ca2+可以有效激活和的表達, 有助于緩解UV-B輻射對和表達的抑制作用。表明Ca2+通過激活的高效表達, 促進腐胺從多胺代謝轉向TAs合成,的高表達有利于托品酮生成托品的支流方向, 進而提高莨菪堿和東莨菪堿的產量。

4 結論

UV-B輻射不利于顛茄的正常生長與次生代謝物的積累, 外源Ca2+可有效緩解UV-B輻射對顛茄的脅迫效應, 有利于顛茄光合作用, 促進無機氮源的同化, 加速無機氮源轉化為自身所需的含氮化合物, 進而有利于顛茄次生代謝途徑中前體物質合成。雖然UV-B輻射可促進基因的表達, 但不利于和基因的正常表達, 降低了莨菪堿和東莨菪堿的合成效率, 而適宜濃度的外源Ca2+可有效解除UV-B對顛茄次生代謝的抑制效應。

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Effect of Exogenous Ca2+on Physiological Characteristics and Secondary Metabolites accumulation ofL. Seedlings under UV-B Stress

LU Ke-Huan1, LIU Xing1, YANG Yi1, LIAO Zhi-Hua2,and WU Neng-Biao1,*

1Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education / School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

Ultraviolet B (UV-B) radiation does harm to plant, for which growth and development. Ca2+is one of the most necessary elements. Exogenous Ca2+can enhance plant abilities to resist stress and regulate secondary metabolism. In this research, we usedL. seedlings to investigate the effects of different concentrations of exogenous Ca2+and different treatment days on the physiological characteristics, nitrogen metabolism, secondary metabolites content and relative genes expression levels of three key enzymes in secondary metabolism under the background of UV-B radiation. The UV-B radiation not only caused inhibitory effect on theL. photosynthesis, nitrogen metabolism, alkaloid content, but also increased peroxidation of membrane lipid. Theo, MDA content gradually decreased, but thevm, photosynthetic pigment content, antioxidant enzyme activity gradually increased under Ca2+treatment, showing that Ca2+is propitious to relieve inhibitory effect on photosynthesis and enhance resistance to UV-B stress. Moreover, Ca2+reduced the content of nitrate nitrogen significantly, promoted the contents of free amino acids, soluble proteins, atropine alkaloids, and raised the activities of key enzymes in nitrogen metabolism. Using real-time fluorescence quantitative PCR, we found that exogenous Ca2+increased the relative gene expression levels of three key enzymes in secondary metabolism in different degrees. This research could provide a theoretical references for plantation in the field.

UV-B stress;L.; physiological characteristics; nitrogen metabolism; tropane alkaloids

2018-01-15;

2018-07-20;

2018-08-01.

10.3724/SP.J.1006.2018.01527

吳能表, E-mail: wunb@swu.edu.cn, Tel: 023-68252147

E-mail: lukehuan@163.com

本研究由國家自然科學基金項目(30500041)和重慶市科技攻關計劃項目(cstc2012gg-yyjs80013)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30500041) and the Science Technology Breakthrough Plan Project of Chongqing (cstc2012gg-yyjs80013).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180731.1057.002.html