王安平，關(guān)瑋琨，李春林，伍 鋼，劉 犇

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000）

布魯菌?。ê?jiǎn)稱布病）是由布魯菌引起的一種 人和多種動(dòng)物感染的全球性疾病，其發(fā)病特征以流產(chǎn)和發(fā)熱為主，在家畜中以牛、羊、豬感染該病最為常見，由于其可以傳染給其他家畜和人，所以有效預(yù)防該病在公共衛(wèi)生方面有重要意義［1］。該病的特征為隱性感染，只有在母畜懷孕時(shí)才表現(xiàn)為流產(chǎn)，從而影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖戶造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。1955年布病作為一種人畜共患病在我國被法定公告，人類可以通過直接接觸受感染的動(dòng)物或食用未經(jīng)充分滅菌的動(dòng)物產(chǎn)品而被感染，在1955—2014年，共有513 034例布魯菌病病例，其中華北地區(qū)報(bào)告了99.3%，受影響地區(qū)從北方牧區(qū)向鄰近草原、農(nóng)業(yè)區(qū)、南部沿海、西南地區(qū)擴(kuò)展［2］。我國大部分省、市、自治區(qū)都發(fā)現(xiàn)布病，其中主要以內(nèi)蒙古、東北、西北牧區(qū)的牛、羊布病流行嚴(yán)重［3］。由于布病的臨床癥狀不明顯，所以布病的檢測(cè)需要結(jié)合細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)診斷方法才能確診。雖然近年來出現(xiàn)不少新的方法用來檢測(cè)布病，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、DNA探針等，但由于檢測(cè)成本高昂，操作要求嚴(yán)格，大型儀器不方便搬運(yùn)等劣勢(shì)限制了其在現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用，所以虎紅平板凝聚試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)依然是布病普查的主 要方法［3］。

該研究為掌握江西省宜春市某肉牛場(chǎng)布病感染狀況，防止工作人員感染，維護(hù)公共衛(wèi)生安全，對(duì)該肉牛場(chǎng)進(jìn)行布魯菌病檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、布魯菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、布魯菌病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、布魯菌病試管凝集試驗(yàn)抗原、稀釋液等均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，滅菌生理鹽水和無水乙醇由宜春學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要耗材及設(shè)備

主要有20號(hào)針頭、一次性使用真空采血管、滅菌試管、試管架、移液槍及槍頭、離心機(jī)和高壓滅菌鍋等。

1.3 血清的制備

用韁繩保定好牛后，將牛頭固定進(jìn)行頸靜脈采血：用碘酊和酒精消毒后按壓頸靜脈使其怒張，用20號(hào)針頭以飛針法快速扎入，采血管稍傾斜接血；接血后標(biāo)記上相應(yīng)的耳標(biāo)號(hào)，靜置20 min后3 000 r/min離心5 min，將上清液小心吸入離心管中，-20℃保存待檢。在該過程中一定要做好個(gè)人的防護(hù)工作。

1.4 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RPBT）

將玻璃板清洗干凈，用黑色記號(hào)筆劃分為等面積的36個(gè)方格，每個(gè)方格左上角寫上相應(yīng)的耳標(biāo)號(hào)。從-20℃冰箱內(nèi)取出血清，先置于4℃冷藏處解凍3 h，再取出恢復(fù)至室溫待檢。在每個(gè)方格中央滴加0.03 mL虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原，然后按相應(yīng)的耳標(biāo)號(hào)滴加0.03 mL受檢血清，使血清和抗原混合均勻、散開、呈較大的圓形，4 min后觀察結(jié)果。同時(shí)在潔凈的載玻片上設(shè)置陰性、陽性對(duì)照組以及空白對(duì)照組，分別取布魯菌病陰性血清、陽性血清和滅菌生理鹽水各0.03 mL滴加于玻片上，再分別加入等量虎紅平板凝集抗原充分混勻，4 min后觀察結(jié)果。陽性血清對(duì)照反應(yīng)時(shí)間過后出現(xiàn)凝集顆粒，呈點(diǎn)狀或線狀，顏色為淡紅色、粉紅色，界限分明（如圖1a所示）；陰性血清對(duì)照表現(xiàn)為無凝集顆粒，呈粉紅色、均勻透明，如圖1b所示。參照陰、陽性血清對(duì)照組對(duì)受檢血清進(jìn)行判斷，受檢血清在4 min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見顆粒狀或絲狀顆粒凝集現(xiàn)象，判為陽性；呈均勻粉紅色、無凝集顆?，F(xiàn)象，判為陰性［4］；出現(xiàn)微量的凝集顆粒，或顏色分布不均勻且邊緣出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，判為假陽性，需要重新測(cè)定。

圖1 虎紅平板凝集試驗(yàn)

圖2 試管凝集試驗(yàn)

1.5 試管凝集試驗(yàn)（SAT）

首先按說明書進(jìn)行比濁管的制備，具體制備體系如表1所示。制備后的比濁管呈現(xiàn)出不同程度的渾濁度，如圖2a所示。每組血清排列5個(gè)試管標(biāo)明編號(hào)， 分別對(duì)應(yīng) 1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200倍稀釋。在每組第1個(gè)試管中滴加1.15 mL稀釋液，其他4個(gè)試管加入 0.5 mL稀釋液；在每組第1個(gè)試管中滴加被檢血清0.1 mL，混合均勻后吸取0.5 mL到下一個(gè)試管，依次進(jìn)行倍比稀釋，最后一個(gè)試管和第一個(gè)試管分別棄去0.5 mL和0.25 mL的混合液；5支試管調(diào)配好后各管液面高度幾乎一致，若液面相差過大則應(yīng)重新配制。5支試管均加入0.5 mL 1∶20倍稀釋抗原，放入37℃溫箱中反應(yīng)22 h后取出，室溫下靜置2 h進(jìn)行結(jié)果的判讀與記錄。結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：菌體完全凝集，上層液體100%清亮相當(dāng)于0懸液，記為++++；菌體基本完全凝集，上層液體清亮度為75%，記為+++；菌體凝集顯著，上層液體清亮度為50%，記為++；弱陽性表現(xiàn)為有凝集物沉淀，液體清亮度25%，記為+；陰性表現(xiàn)為試管內(nèi)液體無沉淀物，表現(xiàn)為均一性渾濁液體，清亮度為0，相當(dāng)于100%懸液，記為-。牛的待測(cè)血清在1∶100稀釋度四號(hào)管出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，可判定為陽性；若在1∶50稀釋度三號(hào)管出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，為可疑。將可疑血清待3～4周后復(fù)檢，假如結(jié)果仍為可疑，則可判定為陽性［4］。

表1 比濁對(duì)照管的配制

2 結(jié)果

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過虎紅平板凝集試驗(yàn)，在60份牛血清（見圖1c）中，檢出50份陰性血清，10份為可疑血清，陽性可疑率達(dá)到16.7%。

2.2 試管凝集試驗(yàn)結(jié)果

通過虎紅平板凝聚試驗(yàn)測(cè)出10個(gè)可疑血清樣本。為了進(jìn)一步判定結(jié)果，進(jìn)行布病試管凝集試驗(yàn)。在10份牛可疑血清中，經(jīng)試管凝集試驗(yàn)，顯示10份都為陰性（見圖2e、f）。該次調(diào)查中布魯菌病陰性符合數(shù)為60頭，陰性符合率100%（60/60），初步判定該牛場(chǎng)布病的感染率為0。

3 討論

在采血過程中要注意自身的安全防護(hù)，組員要分工明確。采血時(shí)間應(yīng)在早晨飼喂前或停食（但要保證充足的飲水）后6 h進(jìn)行，以免出現(xiàn)血清渾濁問題［5］。采血進(jìn)針前一定要對(duì)進(jìn)針部位進(jìn)行消毒，保證不溶血、無污染、無腐敗。采血時(shí)，一定要注意自身安全和防護(hù)，因?yàn)椴疾】梢越?jīng)皮膚黏膜接觸感染，所以操作人員要穿防護(hù)衣、戴手套，如有破損應(yīng)立即更換。避免皮膚黏膜與牛直接接觸。扎針時(shí)，因?yàn)榕Ｍ蝗粩[動(dòng)會(huì)對(duì)采血者造成傷害，所以保定人員要將牛保定好，以便于找到牛的頸靜脈進(jìn)行采血。

虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）操作十分方便、快捷，一般適用于大規(guī)模的布病流行病學(xué)調(diào)查及布魯菌病陰、陽性檢測(cè)，但該檢測(cè)方法特異性會(huì)受到時(shí)間的影響，有時(shí)血清放置過久，陰性動(dòng)物可能出現(xiàn)假陽性。這時(shí)需要將試管凝集試驗(yàn)（SAT）與其結(jié)合起來運(yùn)用，提高特異性，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。操作時(shí)要注意以下事項(xiàng)：虎紅平板凝集試驗(yàn)要選用潔凈的玻璃板，不能有水，不能有污漬，在上面要用黑色記號(hào)筆劃分等面積的方格。從-20℃冰箱內(nèi)取出血清后，需先放于 4℃冷藏處解凍3 h，再拿出來放在室溫下恢復(fù)到常溫。這樣操作可避免將血清從-20℃拿到室溫環(huán)境中，因溫差過大而破壞血清，產(chǎn)生沉淀物。

目前該市還沒有系統(tǒng)的關(guān)于牛布病的流行病學(xué)調(diào)查，但布病的控制和凈化日益受到國家的重視和政府的大力支持，因此掌握該病的流行情況至關(guān)重要。該次流行病學(xué)調(diào)查顯示布病感染率為0，說明宜春市在布病防控上取得了一定成效。

布病防控應(yīng)當(dāng)著重體現(xiàn)“預(yù)防為主，防治結(jié)合”的原則，采用檢疫、免疫、淘汰患病動(dòng)物等措施。一定要重視對(duì)布魯菌病的監(jiān)測(cè)，如在布魯菌病陽性率高的地區(qū)，可以反復(fù)加強(qiáng)檢測(cè)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)陽性動(dòng)物立即淘汰，控制陽性率，凈化牛、羊群；根據(jù)布魯菌病的流行病學(xué)特點(diǎn)，科學(xué)制定相應(yīng)地區(qū)的防控方法，分地區(qū)進(jìn)行綜合重點(diǎn)治理，及時(shí)切斷源頭。特別是在大型養(yǎng)殖場(chǎng)，消毒衛(wèi)生不嚴(yán)格、飼養(yǎng)密度過大以及通風(fēng)較差都會(huì)引起布病的發(fā)生［6-7］，因此，一定要做好奶牛日常的飼養(yǎng)管理工作，并定期對(duì)牛群進(jìn)行布魯菌病的檢測(cè)，從而保障畜牧業(yè)又好又快地發(fā)展。