張 浩，郭虹彩，馬文奎，曹金元

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442）

目前，動(dòng)物細(xì)菌性疾病十分普遍，嚴(yán)重危害我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。在基層疾病診療過(guò)程中，大量使用抗菌藥物的情況極其普遍，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，甚至個(gè)別養(yǎng)殖戶在飼料中添加多種抗菌藥以減少疾病的發(fā)生。由于長(zhǎng)期濫用抗生素致使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，造成養(yǎng)殖成本增加，畜產(chǎn)品存在藥物殘留，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)危及人類的健康。在治療畜禽疾病時(shí)，通過(guò)藥敏試驗(yàn)判斷抗生素藥物對(duì)病原微生物抑菌效果，從而在最短的時(shí)間內(nèi)找出最有效的抗菌藥物，解決生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問(wèn)題，在臨床上可以防止濫用抗生素［1］。為了節(jié)約藥敏試驗(yàn)成本，該試驗(yàn)選取常用的抗菌藥物，按照不同的濃度梯度制成藥敏紙片來(lái)檢測(cè)大腸桿菌對(duì)藥物的敏感度，并與市場(chǎng)上銷售的藥敏紙片進(jìn)行對(duì)比，從而建立一種簡(jiǎn)單快速制備藥敏紙片的方法，有效地指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌藥物：試驗(yàn)選取獸醫(yī)臨床上常用的青霉素G、卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星、鏈霉素、頭孢噻呋鈉6種抗菌藥物。

1.1.2 培養(yǎng)基：選擇營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （批號(hào)：20180305）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20180420）3 種培養(yǎng)基用于大腸桿菌［2］藥敏測(cè)試。培養(yǎng)基均購(gòu)于北京天壇生物制品股份有限公司，其制備按廠家提供的說(shuō)明方法進(jìn)行。

1.1.3 試驗(yàn)菌種：大腸桿菌菌株采購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.4 試驗(yàn)器材：數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 （HPX-9272MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、超凈工作臺(tái)（VS-1300L-U，蘇州安泰）、電子天平（FA2204B，上海佑科儀器儀表有限公司）、微量移液器、手提式不銹鋼蒸汽消毒器（YXQ-LS-18SI，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、海爾冰箱（BCD-322WCKGN33A2S0C）、90 mm培養(yǎng)皿、濾紙、涂布器、不銹鋼打孔器。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物的配制：按照廠家推薦藥物治療量［3］，制備治療量（標(biāo)記 1×）、2 倍治療量（標(biāo)記 2×）和4倍治療量（標(biāo)記4×）的抗菌藥物原液，過(guò)濾除菌后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紙片的制備：利用打孔器將110 mm的定性濾紙打成直徑為6 mm［4］的圓形小紙片，放入清潔干燥的青霉素空瓶中，每瓶放入50片，用牛皮紙包好瓶口并用小線扎緊，高壓滅菌（121℃，15 min），烘干，密封備用。

1.2.3 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配制：作為溶劑起溶解、保護(hù)藥品的作用，參照《培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》［5］配制 PBS。

1.2.4 藥敏紙片的制備：在無(wú)菌條件下（超凈工作臺(tái)要求的環(huán)境），分別吸取不同濃度的藥液0.5 mL加入裝有紙片的青霉素瓶中，用牛皮紙密封瓶口，浸泡1 h，讓藥液被紙片充分吸凈；然后將紙片散開放入滅菌的培養(yǎng)皿中，無(wú)菌室擱置過(guò)夜，待紙片完全干燥后，收集在青霉素瓶?jī)?nèi)，密封，貼好標(biāo)簽，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果觀察：利用超凈工作臺(tái)的工作環(huán)境，用接種環(huán)挑取大腸桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后取出，輕輕振蕩使菌液均勻、混濁；用微量移液器吸取0.5 mL，注入做好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，然后用涂布器將菌液均勻推開；待菌液被培養(yǎng)基吸收后用滅菌鑷子將制備好的藥敏紙片貼在培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)貼5個(gè)不同的紙片（中間1片，周圍4片）。同時(shí)，按上述方法將從市場(chǎng)上購(gòu)買來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片也貼于涂有大腸桿菌的培養(yǎng)皿中做對(duì)比。將培養(yǎng)皿放入電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h后取出，用直尺測(cè)量抑菌圈直徑，測(cè)量3次取其平均值，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)抑菌圈直徑大小作為判斷藥物敏感程度標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑越大說(shuō)明細(xì)菌對(duì)該藥物的敏感性越高［6］。各種抗菌藥物的判斷標(biāo)準(zhǔn)［7］見(jiàn)表 1。

表1 不同抗菌藥物抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

不同濃度抗菌藥物的自制藥敏紙片和市售藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌效果［8］見(jiàn)表2。由表2可知，3個(gè)不同濃度的青霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均為0，青霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；2倍治療量、4倍治療量的卡那霉素自制藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均為18 mm （敏感），市售卡那霉素藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為21 mm（敏感），2倍治療量、4倍治療量的卡那霉素自制藥敏片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；3個(gè)不同濃度的慶大霉素自制藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均大于15 mm（敏感），市售慶大霉素藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為15 mm（敏感），慶大霉素自制藥敏片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；3個(gè)不同濃度的氧氟沙星自制藥敏紙片與市售藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均小于12 mm（耐藥），氧氟沙星自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果一致。3個(gè)不同濃度的鏈霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均小于11 mm（耐藥），鏈霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；3個(gè)不同濃度的頭孢噻呋鈉自制藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均小于14 mm（耐藥），而頭孢噻呋鈉市售藥敏紙片對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均為16 mm（中度敏感），頭孢噻呋鈉自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果不一致。

表2 抗菌藥物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

由以上結(jié)果可以得出，該試驗(yàn)自制的藥敏紙片是成功的。

3 討論

①由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，部分自制藥敏紙片測(cè)量的抑菌圈直徑明顯小于市售的藥敏紙片，原因可能是自制藥敏紙片所含藥液濃度過(guò)低、涂菌不均勻或涂菌過(guò)厚所致［9］。目前市場(chǎng)上銷售劣質(zhì)獸藥的現(xiàn)象比較嚴(yán)重，有些藥物濃度達(dá)不到國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，藥液濃度低，自然抑菌效果就差。

②藥敏試驗(yàn)中菌液濃度的控制很重要。通過(guò)試驗(yàn)，觀察到同樣的操作方法，若每次涂布的細(xì)菌沒(méi)有經(jīng)過(guò)比濁管比對(duì)［1］，它所產(chǎn)生的抑菌圈直徑會(huì)有差異，影響藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確性。

③由于部分藥物臨床上用量較少，稱量時(shí)容易造成結(jié)果出現(xiàn)誤差。該試驗(yàn)在稱量該類藥品時(shí)先擴(kuò)大藥量，然后進(jìn)行倍數(shù)稀釋，以減少誤差。

④藥敏紙片和藥液制備過(guò)程中，要做到細(xì)致認(rèn)真，只有這樣才能保證試驗(yàn)結(jié)果盡可能精確。制備好的藥敏紙片置入青霉素瓶中，高壓滅菌后存放-20℃保存?zhèn)溆?，用畢及時(shí)放回，通?？梢员４?年。避免反復(fù)凍融藥敏紙片，從而減少試驗(yàn)結(jié)果的誤差。