覃 桂，聶 晶，張 飛，胡炳雄，肖 凌，汪 波

（湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 武漢 430075）

翠云草（Selaginella uncinata）系蕨類(lèi)卷柏科卷柏屬植物，該屬植物在全世界有700余種，在我國(guó)分布較為廣泛，約有60～70種[1]，其中22種有藥用記載，在湖北分布的藥用種類(lèi)達(dá)14種，以全草入藥，具有清熱、解毒、降糖、鎮(zhèn)痛等多種功效[2,3]，得到廣泛關(guān)注和大量的研究，卷柏（S.tamariscina）和墊狀卷柏（S.pulvinata）作為卷柏藥材基源收載入《中國(guó)藥典》。

作為民間廣泛使用的中草藥品種，翠云草早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，具有清熱利濕、止咳止血、抗菌消炎等功效[4]，現(xiàn)代藥理研究表明其還具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[5,6]，應(yīng)用于黃疸、腸炎、腎炎水腫、肺結(jié)核咳血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、外傷出血等癥的治療，具有較高的藥用價(jià)值。然而，卷柏屬植物紛繁多樣、分類(lèi)復(fù)雜[7,8]，不同種植物間的鑒別性狀存在交叉重疊[9,10]，且調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同生境或不同采收期樣本的性狀存在明顯差異，給翠云草的準(zhǔn)確鑒定帶來(lái)很大困難，給正確用藥造成障礙。因此，建立快速準(zhǔn)確鑒定翠云草的方法對(duì)該重要藥用植物的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用至關(guān)重要。

本研究基于卷柏屬藥用植物DNA條形碼鑒定序列種間變異位點(diǎn)信息，針對(duì)翠云草設(shè)計(jì)特異引物及TaqMan探針，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，比較翠云草及其同屬植物特異片段擴(kuò)增的熒光信號(hào)差異，區(qū)分翠云草及其近源物種，為翠云草的快速鑒定提供檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料分別收集自湖北、湖南、廣西等地（表1），共涉及卷柏屬11種32批，所有樣本均經(jīng)由中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬(wàn)定榮教授鑒定。對(duì)所收集的樣本以75%乙醇擦拭清潔表面后分別編號(hào)，硅膠干燥后保存于湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院中藥檢驗(yàn)所。其余34物種的103條ITS2序列均來(lái)源于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)（表2）。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品信息表

1.2 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

1.2.1 DNA提取

取干燥組織約30 mg，用高通量組織研磨儀（Scientz-48，China）研磨120 s（50 Hz）至呈粉末狀，使用植物DNA提取試劑盒（TIANGEN Biotech（Beijing）Co.,Ltd DP305-02）提取總DNA，并對(duì)該試劑盒抽提及沉淀DNA的方式作如下改進(jìn)：65℃水浴10 min改為水浴過(guò)夜，使用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提2次，使用預(yù)冷的異丙醇放入-20℃冰箱沉淀DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序等參考中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則（《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版通則9107），上游引物2F：CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA；下游引物3R：CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCC ACCPCR，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物純化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.,USA）測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 序列拼接和數(shù)據(jù)分析

測(cè)序峰圖釆用序列拼接軟件CodonCode Aligner V3.71（CodonCode，Dedham，MA，USA）校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)。采用基于隱馬爾可夫模型的HMM注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段即可獲得ITS2間隔區(qū)序列[12]。然后，將所有序列用軟件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比對(duì)[13]，用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，各分支支持率通過(guò)Bootstrap（1000次重復(fù)）進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3 TaqMan探針?lè)ㄨb定翠云草藥材

1.3.1 引物、探針的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲得的11物種32條序列及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的34物種103條序列的序列特征，針對(duì)翠云草種內(nèi)保守及種間高變異區(qū)域，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express v3.0和primer3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)篩選得到一組特異引物和TaqMan探針，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為101 bp，引物及探針委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探針5′端用FAM標(biāo)記，3′端用TAMRA標(biāo)記，引物和探針序列見(jiàn)表3。

1.3.2 熒光PCR反應(yīng)及評(píng)價(jià)驗(yàn)證

基于TaqMan探針的熒光定量PCR反應(yīng)是在ABI stepone plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成，按照Goldstar TaqMan Mixture（CWBIO，CW2625）提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作，25μL反應(yīng)體系：2×GoldStar TaqMan Mixture 12.5μL，引物CYC-R 1μL，引物CYC-F 1μL，探針 CYC-P 1 μL，50×High ROX 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 7.5 μL；熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95°C預(yù)變性10 min；95°C變性15 s，60°C退火60 s，72°C延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min，收集熒光信號(hào)。以翠云草DNA為陽(yáng)性樣品，以除翠云草外的卷柏屬其他樣本DNA為陰性樣品，進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)檢測(cè)以確定該方法的特異性；以從不同翠云草樣品中提取的DNA為模板，應(yīng)用熒光PCR檢測(cè)法進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)與組間試驗(yàn)，每個(gè)樣本做3次平行檢測(cè)，以確定本方法的可重復(fù)性；分別稱(chēng)取1 mg、2 mg、4 mg、10 mg和30 mg的翠云草樣品提取DNA，以其為模板進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，探討該方法靈敏度。

表2 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得卷柏屬植物ITS2序列登錄號(hào)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 種間ITS2序列聚類(lèi)分析

基于本實(shí)驗(yàn)所得卷柏屬序列及Genbank上已發(fā)表序列，以鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)（圖1）。聚類(lèi)分析表明：翠云草能單獨(dú)成支，紅枝卷柏、伏地卷柏、疏松卷柏、鐮葉卷柏、中華卷柏、深綠卷柏、疏葉卷柏也分別與其余物種有明顯分界，而異穗卷柏與劍葉卷柏、江南卷柏與兗州卷柏、卷柏與墊狀卷柏之間遺傳關(guān)系較近，并未呈現(xiàn)較好單系性。本實(shí)驗(yàn)采集的樣品中，同一產(chǎn)地或產(chǎn)地相近（江南卷柏6、7、12、14、15、10、13號(hào)樣品）的樣品先分別聚類(lèi)，再與產(chǎn)地較遠(yuǎn)的其余樣品（江南卷柏8、9號(hào)樣品）聚類(lèi)，說(shuō)明江南卷柏產(chǎn)地相距越遠(yuǎn)，遺傳差異越明顯。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ITS2序列能較好的用于翠云草的聚類(lèi)分析及鑒定，也能較明顯的揭示卷柏屬植物間遺傳差異，為卷柏屬藥用植物資源分類(lèi)鑒定提供了新途徑。

表3 引物與探針序列

2.2 翠云草實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)

2.2.1 特異性驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)RT-PCR儀擴(kuò)增，自動(dòng)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度曲線得到特異性驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2（A），翠云草樣本熒光信號(hào)隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加逐步增強(qiáng)，上升趨勢(shì)明顯，信號(hào)強(qiáng)度與始終無(wú)明顯信號(hào)強(qiáng)度的陰性樣本差異顯著（ΔRn值均相差1.0以上），該結(jié)果表明該方法能準(zhǔn)確反映目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增，引物具有良好的特異性。

2.2.2 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

取兩批翠云草樣本分2組，每組內(nèi)同一樣本做3次平行試驗(yàn)，得到相應(yīng)擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2（B），組間不同翠云草樣本及同組內(nèi)相同翠云草樣本的平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：30個(gè)循環(huán)后，翠云草樣本ΔRn值均大于1.0，每份樣本PCR產(chǎn)物量基本一致，曲線整體走勢(shì)基本相同，該結(jié)果表明該方法具有良好重復(fù)性。

2.2.3 靈敏性驗(yàn)證結(jié)果。

圖1 卷柏屬131條序列聚類(lèi)分析進(jìn)化樹(shù)

圖2 特異性、重復(fù)性、靈敏性驗(yàn)證結(jié)果圖

分別以5種不同取樣量的翠云草樣本DNA為模板，進(jìn)行RT-PCR靈敏度分析見(jiàn)圖2（C）。結(jié)果顯示，當(dāng)取樣量在1 mg以上時(shí)，用建立的RT-PCR方法檢測(cè)能產(chǎn)生較好的特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照無(wú)明顯特異性擴(kuò)增，表明該方法具有較好靈敏性，可從低至1 mg的樣品中提取DNA并得到有效檢出。

3 討論

3.1 ITS2序列在卷柏屬藥用植物翠云草鑒定中的作用

傳統(tǒng)中藥材鑒別主要集中于形態(tài)、顯微及理化鑒別，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益成熟，DNA條形碼鑒定技術(shù)因技術(shù)簡(jiǎn)便、鑒定準(zhǔn)確、使用方便等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于中藥鑒定[13,14、15]，以ITS2/ITS為主體鑒定序列的植物類(lèi)中藥材鑒定體系已收錄入2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，該序列對(duì)卷柏屬植物也具有較高的鑒定效率[16]。在本研究在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，翠云草單獨(dú)成支，可與其它物種很好區(qū)分，表明該序列對(duì)翠云草具有較高的鑒定能力，雖然江南卷柏、兗州卷柏、薄葉卷柏、墊狀卷柏及藤卷柏未能單獨(dú)聚為一支，但并不影響翠云草的鑒定。

3.2 熒光PCR在翠云草快速檢測(cè)中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，能反應(yīng)樣品中靶DNA含量多少及動(dòng)態(tài)變化，現(xiàn)亦被廣泛應(yīng)用于物種鑒定[17,18]，本研究基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，建立了翠云草快速鑒定新方法，并從特異性、重復(fù)性及靈敏性三方面進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，通過(guò)直觀信號(hào)圖可將翠云草與常見(jiàn)同屬近源物種樣本有效區(qū)分，準(zhǔn)確度高、耗時(shí)短，體現(xiàn)了該方法快速、高效、準(zhǔn)確的鑒定特點(diǎn)。相較于形態(tài)學(xué)、顯微結(jié)構(gòu)特征、化學(xué)指紋圖譜等的傳統(tǒng)鑒定方法[19,20]，該方法特異性更強(qiáng)、污染小、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便，并通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度的差異客觀反應(yīng)鑒定結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了翠云草與其它近緣物種準(zhǔn)確、高效的鑒定，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法的不足，為翠云草的快速、準(zhǔn)確鑒定提供了新的技術(shù)途徑，為保障翠云草臨床用藥的有效性提供了技術(shù)支持。