高效污泥降解菌種的篩選及在污泥堆肥中的效果

阮馨怡，劉 曦，關(guān) 玥，孔海南，林 燕

(上海交通大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化水平不斷提高，污水處理設(shè)施建設(shè)高速發(fā)展，截至2015年7月，我國(guó)城鎮(zhèn)污水日處理能力已達(dá)到1.70億 t[1]。一般情況下，污水處理廠每處理1萬(wàn)t生活污水可產(chǎn)生污泥5～8 t，每處理1萬(wàn)t工業(yè)污水可產(chǎn)生污泥10～30 t。考慮到工業(yè)廢水和生活污水未來(lái)排放量變化，預(yù)計(jì)到2020年我國(guó)污泥產(chǎn)量為8 382萬(wàn)t[2]。然而，我國(guó)污泥無(wú)害化處理率至今依然較低，大量污水廠仍采取直接傾倒或簡(jiǎn)單填埋的手段處理污泥，未經(jīng)處理的污泥不僅對(duì)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重威脅，而且大量占用有限的土地資源。厭氧消化可對(duì)大量集中的污泥進(jìn)行處理，且在處理過(guò)程中能達(dá)到能量回收和降低環(huán)境危害的目的，日漸發(fā)展成為污泥穩(wěn)定化及資源化處置過(guò)程中廣泛應(yīng)用的方法。

我國(guó)有250余萬(wàn)個(gè)自然村，其污水排放量約占我國(guó)生活污水總排放量的55%。然而，村鎮(zhèn)污水來(lái)源分散、難于集中，只能通過(guò)建設(shè)小規(guī)模污水處理設(shè)施進(jìn)行處理，但大量分散的污泥無(wú)法使用厭氧消化的方法進(jìn)行集中處理?，F(xiàn)有的針對(duì)小規(guī)模污泥進(jìn)行處理的方法有深度脫水工藝、加鈣干化工藝和好氧堆肥3種技術(shù)路線[3]，其中，深度脫水工藝和加鈣干化工藝都需要對(duì)現(xiàn)有污水處理廠進(jìn)行改造，成本較高，相對(duì)而言，堆肥方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，且能夠同時(shí)達(dá)到污泥處理資源化、無(wú)害化的目的，具有良好的發(fā)展前景。

高溫菌在高溫條件下降解酶活性高、代謝能力強(qiáng)，能縮短生物轉(zhuǎn)化的周期，提高有機(jī)質(zhì)降解效率[4]，在污泥降解轉(zhuǎn)化生產(chǎn)有機(jī)肥領(lǐng)域具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和潛能。本研究從采集的樣品中篩選能在高溫條件下有效降解污泥的菌株，按照一定比例相互混合，研制復(fù)合微生物菌劑，用于污泥的高溫堆肥處理，進(jìn)行好氧堆肥試驗(yàn)，并設(shè)置空白對(duì)照組，定期檢測(cè)堆體中溫度、pH、含水率、有機(jī)質(zhì)含量和種子發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)，旨在提高污泥的降解能力，并將其轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量的有機(jī)肥，為微生物菌劑在污泥堆肥中的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)與菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來(lái)源

試驗(yàn)所用菌種分別采自某地的高溫土壤(編號(hào)T1～T3)、污水處理廠的脫水污泥(編號(hào)W1～W5)、堆肥高溫期的物料(編號(hào)G1、G2)和經(jīng)過(guò)65 ℃好氧堆肥后的腐熟物料(編號(hào)F1、F2)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物 5 g·L-1，氯化鈉 10 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基：脫水污泥(含水率83%)100 g·L-1，瓊脂18 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 堆肥原料

堆肥原料為某污水處理廠脫水污泥和鋸末，具體性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離、純化

取20 g菌源樣品于盛有100 mL無(wú)菌水的250 mL錐形瓶中， 200 r·min-1振蕩20 min，靜置30 min，得到上清液。取上清液涂布于分離培養(yǎng)基，將平板倒置于55 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。長(zhǎng)出菌落后，進(jìn)行多次平板劃線直至純化。篩選得到的菌株于相應(yīng)的試管中斜面4 ℃保存。

1.2.2 菌株制備

在250 mL錐形瓶中裝入配置好的LB培養(yǎng)基，分別接入保存的單菌，貼好標(biāo)簽，55 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r·min-1離心10 min。倒掉培養(yǎng)基，加入配置好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%的生理鹽水振蕩搖勻，離心。重復(fù)清洗3次后，用超純水代替生理鹽水再進(jìn)行該步驟，離心后收集菌體備用。

1.2.3 菌株篩選

以脫水污泥為主材料，根據(jù)C/N，配一定質(zhì)量的鋸末制成堆肥原料(C/N在25～30之間，水分含量在60%左右)，充分混勻后，分裝于250 mL錐形瓶中，每瓶20 g。按5%接種量接種各菌株，55 ℃、170 r·min-1振蕩5 d。測(cè)定污泥有機(jī)質(zhì)降解率和水分去除率，同時(shí)設(shè)置不接種菌株組作為空白對(duì)照，篩選出降解效率高的菌株。

表1堆肥原料成分

Table1Main composition of composting raw materials

試驗(yàn)材料Experimental materials含水率Water content/%pH有機(jī)碳Organic carbon/%全氮Total nitrogen/%C/N脫水污泥 Dehydrated sludge78.157.6735.304.877.25鋸末Sawdust27.367.4645.470.35131.78

將篩選出的4株降解率較高的菌株，按照等比例分別進(jìn)行兩兩組合、三者混合或全混合，統(tǒng)一采用5%的接種量，同前述方法，篩選出降解效率高的菌株組合。

1.2.4 菌株鑒定

菌株的形態(tài)及生理生化鑒定方法參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[5]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]。對(duì)菌株進(jìn)行生物學(xué)鑒定，待測(cè)目的菌株以菌液為模板，采用通用引物27F/1492R進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共24個(gè)循環(huán)；72 ℃保持10 min，10 ℃終止。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并利用Blast程序與基因庫(kù)中的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)各菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 污泥高溫堆肥試驗(yàn)

以脫水污泥為主要材料，加入鋸末調(diào)節(jié)初始含水率至60%左右、C/N在25～30之間。以1.2.3節(jié)選定的菌株組合作為試驗(yàn)材料，分別按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、5%和10%的比例添加于堆體中，并設(shè)置不加菌種組合的空白組，每個(gè)堆體3.5 kg，其他試驗(yàn)條件相同。試驗(yàn)持續(xù)21 d，每2 d翻堆1次。每天測(cè)定堆體溫度，同時(shí)記錄室溫。每隔1 d取樣，測(cè)定含水率、pH值、有機(jī)質(zhì)含量，以及種子發(fā)芽指數(shù)。

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定

溫度采用水銀溫度計(jì)進(jìn)行測(cè)量；含水率采用烘箱干燥法測(cè)定，105 ℃烘干至恒重；pH值參照NY 525—2012中方法測(cè)定；種子發(fā)芽指數(shù)參照GB/T 23486—2009中方法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)含量參照文獻(xiàn)[7]方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選

2.1.1 單菌株降解效果比較

由圖1可知，經(jīng)過(guò)5 d的降解，空白組有機(jī)質(zhì)降解率為22.37%，投加外源菌的各試驗(yàn)組的有機(jī)質(zhì)去除率均高于空白組，其中，有機(jī)質(zhì)去除率最高的菌株為W4(近50%)，其次是T1、T2和G1，有機(jī)質(zhì)去除率都在35%左右，剩余菌株的有機(jī)質(zhì)去除率均在30%左右。相對(duì)于張小娟等[8]模擬堆肥5 d最高24.7%的有機(jī)質(zhì)降解率，本試驗(yàn)供試菌株的有機(jī)質(zhì)降解率均在較高水平。W4菌株的有機(jī)質(zhì)降解率最高，這可能是因?yàn)槠浞蛛x自脫水污泥，更適應(yīng)于污泥環(huán)境。T1、T2和G1菌株均分離自55 ℃以上的高溫環(huán)境，因此在試驗(yàn)條件下也較適應(yīng)，但對(duì)污泥中有機(jī)質(zhì)的降解能力不如W4。

與有機(jī)質(zhì)去除率的結(jié)果類似，投加外源菌的各試驗(yàn)組的水分去除率也都高于空白組，水分去除率最高的菌株同樣為W4，去除率23.37%，是對(duì)照組的1.9倍，G1、T1和T2菌株試驗(yàn)組的水分去除率在16%左右，約為對(duì)照組的1.3倍。王亮等[9]堆肥試驗(yàn)5 d的最高水分去除率為14.8%，與之相比，本試驗(yàn)中供試菌株的水分去除率亦較高。

對(duì)比水分去除率和有機(jī)質(zhì)降解率的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者變化趨勢(shì)一致，即有機(jī)質(zhì)降解率越高的處理，其水分去除率也相對(duì)越高。這可能是由于微生物降解有機(jī)質(zhì)的過(guò)程中釋放的熱量使水分揮發(fā)，有機(jī)質(zhì)降解越多，產(chǎn)生的熱量越多，對(duì)水分去除的作用亦越強(qiáng)。綜合前述試驗(yàn)結(jié)果可知，G1、T1、T2、W4是本次試驗(yàn)分離鑒定出的優(yōu)勢(shì)菌，其中，以W4菌株對(duì)污泥的有機(jī)質(zhì)降解率最高。

2.1.2 菌株組合降解效果比較

單一的細(xì)菌、真菌、放線菌群體，無(wú)論其活性多高，在加快堆肥化過(guò)程中的作用都比不上混合微生物菌群的共同作用[10]。從圖2可知，各菌種組合中，有機(jī)質(zhì)去除率最高的為H11處理，即將G1、T1、T2、W4以1∶1∶1∶1的比例混合，在試驗(yàn)條件下有機(jī)質(zhì)去除率高達(dá)55.69%，是空白對(duì)照組的2.63倍。H7處理的有機(jī)質(zhì)降解率也較高，與H11處理接近。水分去除率最高的處理同樣為H11，去除率達(dá)26.98%，是空白對(duì)照組的2.16倍，其次是H7處理，去除率25.51%。

與單菌株試驗(yàn)結(jié)果相比，H11處理的有機(jī)質(zhì)降解率和水分去除率提升進(jìn)一步提高，效果更佳。

2.2 菌種鑒定

對(duì)篩選出的4株菌(G1、T1、T2、W4)進(jìn)行菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)鑒定。上述4株菌在55 ℃下培養(yǎng)24 h，在固體培養(yǎng)基中均形成乳白色不透明菌落，顯微鏡下觀察為單獨(dú)桿狀菌。G1菌落假根狀，邊緣絲狀，表面扁平，較干燥。T1菌落假根狀，邊緣絲狀，表面凹陷，光滑，較干燥。T2菌落圓形，邊緣絲狀，表面隆起，粗糙，較干燥。W4菌落圓形，邊緣波狀，表面凸透鏡狀，光滑，較干燥。

圖1 不同菌株在污泥模擬堆肥條件下的有機(jī)質(zhì)降解率和水分去除率Fig.1 Degrading rate of organic matter and water removal rate of different strains under simulated sludge composting

H1， G1T1; H2， G1T2; H3， G1W4; H4， T1T2; H5， T1W4; H6， T2W4; H7， G1T1T2; H8， G1T1W4; H9， G1T2W4; H10， T1T2W4; H11， G1T1T2W4.圖2 不同菌株組合在污泥模擬堆肥條件下的有機(jī)質(zhì)降解率和水分去除率Fig.2 Degrading rate of organic matter and water removal rate of different strain combinations under simulated sludge composting

由表2可以看出，4株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁厚，在面對(duì)不良生存條件下，可更好地保持細(xì)胞外形，抑制機(jī)械和滲透損傷從而保護(hù)細(xì)胞。G1菌株的甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陰性，與葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為產(chǎn)堿菌株相對(duì)應(yīng)，而T1、T2和W4菌株均能分解葡萄糖產(chǎn)酸，甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，并與葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果為發(fā)酵菌株相對(duì)應(yīng)。4株菌均能水解淀粉，產(chǎn)硫化氫，這也是菌落形成過(guò)程中聞到輕微臭味的原因，不過(guò)味道較輕，不影響后續(xù)使用。4株菌均不能分解纖維素或使明膠液化，說(shuō)明菌株在遇到纖維素、蛋白質(zhì)大分子有機(jī)物時(shí)，仍需與其他微生物配合進(jìn)行作用。

對(duì)4株菌進(jìn)行16S rDNA分析，結(jié)果顯示，G1、T1、T2、W4分別與嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusthermoamylovorans)、嗜熱芽孢桿菌(Bacillusthermolactis)、芽孢桿菌(Bacillussp. TAT112)、芽孢桿菌(Bacillussp. HR1)的一致性均達(dá)到99%， 4株菌均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.3 污泥高溫堆肥試驗(yàn)

2.3.1 堆肥過(guò)程中堆體溫度的變化

堆肥溫度變化能夠反映不同階段微生物的代謝活性，是堆肥過(guò)程最直觀也是最重要的參數(shù)，也是決定堆肥能否順利進(jìn)行并完成的重要因素。由圖3可知，4個(gè)處理堆體的變化趨勢(shì)一致。整個(gè)堆肥過(guò)程可以根據(jù)溫度不同分為3個(gè)階段：0～2 d，升溫階段；2～4 d，高溫階段；4～21 d，降溫階段。在適宜的含水率、C/N和氧氣濃度下，微生物通過(guò)分解有機(jī)物產(chǎn)生大量的熱量，使堆體迅速升溫，在堆肥的第2天，加入菌株組合的3個(gè)堆體溫度迅速升高，達(dá)到55～63 ℃，其中，以添加3%菌株組合的處理堆溫最高(63 ℃)，隨著菌株組合添加量的提高，堆體所達(dá)到的最高溫度降低。這可能是由于所加入的微生物量過(guò)多，與污泥中的土著微生物形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，無(wú)法維持菌種之間的生態(tài)平衡，或者是由于加入的微生物之間因生存競(jìng)爭(zhēng)而大量死亡所致[11]。空白組的最高堆溫雖然也達(dá)到了53 ℃，但升溫幅度明顯低于加入處理組。加入菌株組合的3個(gè)堆體堆溫在55 ℃以上維持4 d，能夠起到殺滅致病微生物的作用。堆肥21 d后，4個(gè)堆體的溫度趨于穩(wěn)定，較接近環(huán)境溫度，說(shuō)明堆肥過(guò)程結(jié)束?？傮w來(lái)看，加入微生物菌株組合可以提高堆肥升溫速率和最高溫度，延長(zhǎng)高溫期。

2.3.2 堆肥過(guò)程中堆體含水率的變化

表2菌株生理生化特征

Table2Physical and biochemical character of strains

檢測(cè)指標(biāo)Measurement index菌株StrainG1T1T2W4革蘭氏染色Gram stain++++甲基紅試驗(yàn)Methyl red test-+++乙酰甲基甲醇試驗(yàn)Voges-Proskauer test----淀粉水解試驗(yàn)Starch hydrolysis test++++檸檬酸鹽試驗(yàn)Citrate test----明膠液化試驗(yàn)Gelatin liquefaction test----葡萄糖胺試驗(yàn)Glucosamine test+--+纖維素分解試驗(yàn)Cellulose decomposition test----葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)Glucose oxidative fermentation test產(chǎn)堿Alkali-producing發(fā)酵Fermentation發(fā)酵Fermentation發(fā)酵Fermentation產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)Hydrogen sulfide production test++++半固體穿刺試驗(yàn)Semi-solid puncture test無(wú)None擴(kuò)散Diffused擴(kuò)散Diffused擴(kuò)散Diffused

+表示陽(yáng)性，-表示陰性。

+ indicated positive; - indicated negative.

水分是影響堆肥物料腐熟速度的重要參數(shù)，合適的水分是保持微生物最佳活性的必要條件。由圖4可知，4組堆體的含水率均呈下降趨勢(shì)，接種菌株組合的堆體含水率下降速度明顯快于空白組，尤其在前3 d表現(xiàn)較為突出，之后變化較為平緩。各處理中，以3%添加量的堆體效果最好，含水率下降了18.9%，是空白組的1.45倍，高于張小娟等[8]堆肥中10.27%的水分去除率。微生物在分解有機(jī)物的同時(shí)產(chǎn)生大量熱量，使堆體溫度升高，加快了水分散失[12]。空白組的含水率也呈下降趨勢(shì)，是污泥中本身所含微生物所致，但由于土著微生物在堆肥過(guò)程中活性較差，整體的含水率變化較為平緩。

2.3.3 堆肥過(guò)程中堆體pH的變化

圖3 堆肥過(guò)程中堆體溫度的變化Fig.3 Dynamics of temperature during composting

圖4 堆肥過(guò)程中堆體含水率的變化Fig.4 Dynamics of water content during composting

堆肥過(guò)程中堆體微生物的有機(jī)降解活動(dòng)，需要在一個(gè)適宜的酸堿條件下進(jìn)行。研究認(rèn)為，堆肥最適宜的pH范圍為5.5～8.0，由圖5可知，4個(gè)堆體的pH值均處于此范圍之內(nèi)，且均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與弓鳳蓮等[13]研究結(jié)果一致。這是由于：堆肥初期微生物氨化作用分解含氮化合物，產(chǎn)生大量不能及時(shí)揮發(fā)的氨氣，導(dǎo)致物料的pH增大；堆肥后期氨化作用減弱，而硝化作用增強(qiáng)，同時(shí)有機(jī)物分解產(chǎn)生有機(jī)酸，故致pH下降。對(duì)照?qǐng)D3可以看出，高pH環(huán)境的維持時(shí)段與高溫維持時(shí)段基本一致，都是由微生物分解有機(jī)物造成的，該時(shí)段正值微生物，尤其是嗜熱微生物的活躍期。3%添加量的堆體溫度最高，但其堆體pH值并未明顯高出其他堆體，這有利于減少堆肥過(guò)程中NH3的揮發(fā)，保持堆肥肥效。

2.3.4 堆肥過(guò)程中堆體有機(jī)質(zhì)含量的變化

堆肥過(guò)程中有機(jī)物在微生物的作用下會(huì)分解為CO2、水等小分子物質(zhì)，同時(shí)又會(huì)合成新的物質(zhì)——腐殖酸，所以在堆肥過(guò)程中，有機(jī)質(zhì)的含量是不斷減少的。從圖6可以看出，4個(gè)堆體的有機(jī)質(zhì)含量均呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì)，加入菌株組合的處理相對(duì)于空白組，其有機(jī)質(zhì)含量在初始情況下變化幅度小。這可能是由于加入微生物菌株組合后，需要與污泥中原有的微生物群落進(jìn)行相互適應(yīng)。加入微生物菌株組合的堆體在整個(gè)堆肥過(guò)程中有機(jī)質(zhì)降解率波動(dòng)較小，相對(duì)穩(wěn)定。在整個(gè)堆肥過(guò)程中，4個(gè)堆體中的有機(jī)質(zhì)都得到了有效的分解，最終的有機(jī)質(zhì)含量在74%～78%。其中，3%添加量堆體的有機(jī)質(zhì)含量在21 d內(nèi)由最初的87.9%下降到74.85%，高于宮曉梅等[14]和孫干等[15]試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明選定的微生物菌株組合可以加快堆體中有機(jī)物的分解。

2.3.5 堆肥過(guò)程中堆體種子發(fā)芽指數(shù)的變化

種子發(fā)芽指數(shù)是表征堆肥有無(wú)毒性的重要指標(biāo)，種子發(fā)芽率越高則堆體毒性越小，腐熟度越好。一般情況下，種子發(fā)芽指數(shù)大于80%可認(rèn)為堆肥達(dá)到完全腐熟，對(duì)種子基本無(wú)毒性[16]。由圖7可知，添加微生物菌株組合的堆體，種子發(fā)芽指數(shù)呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)，添加3%、5%、10%菌種組合的堆體自15 d起，其種子發(fā)芽指數(shù)陸續(xù)達(dá)到80%以上，達(dá)到完全腐熟，堆肥結(jié)束時(shí)，其種子發(fā)芽指數(shù)分別為134.10%、118.58%、103.36%，以3%添加量處理的種子發(fā)芽指數(shù)最高，堆體毒性最小，而空白組最終種子發(fā)芽指數(shù)低于50%，未達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)。這說(shuō)明選定的微生物菌株組合能快速有效地分解有毒物質(zhì)，縮短堆肥周期。

圖5 堆肥過(guò)程中堆體pH的變化Fig.5 Dynamics of pH during composting

圖6 堆肥過(guò)程中堆體有機(jī)質(zhì)含量的變化Fig.6 Dynamics of organic matter content during composting

圖7 堆肥過(guò)程中堆體種子發(fā)芽指數(shù)的變化Fig.7 Dynamics of germination index during composting

3 小結(jié)

本研究共篩選出4株污泥高效降解菌株，經(jīng)鑒定，均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，將其以相同比例混合，并以不同劑量添加至污泥堆肥中，結(jié)果表明，當(dāng)添加量為3%時(shí)，堆肥效果最優(yōu)，堆溫升高，高溫期延長(zhǎng)，且堆肥周期縮短，所選定的菌株組合在污泥堆肥中有一定的應(yīng)用潛力。