利用SSR分子標記鑒定刺葡萄F1代雜種

蘇聰聰， 金 燕， 徐 豐， 白 描， 石雪暉， 楊國順， 鐘曉紅， 劉昆玉， 陳陳恒， 李含晰

(湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院/湖南省葡萄工程技術研究中心，湖南長沙 410128

刺葡萄(VitisdavidiiFoex)是葡萄科葡萄屬東亞種群的一個特色野生葡萄種質(zhì)資源[1]，可作為釀酒和制汁的優(yōu)質(zhì)原料。但目前栽培刺葡萄品種或類型存在果實含糖量偏低與果實香氣不明顯的缺陷。因此，選擇風味獨特、果香濃郁的歐亞種或歐美雜種葡萄品種如玫瑰香、金手指、香妃等，與其進行種間雜交，以改良刺葡萄品質(zhì)，培育出優(yōu)質(zhì)的刺葡萄新品種。

在雜交過程中，由于葡萄可能受外源花粉污染或因閉花受精自交結實等原因，可能造成雜交后代真假雜種苗混雜，因此對雜種后代進行真實性鑒定是后期遺傳研究的前提。用于植物雜交后代的鑒定方法，主要有植株形態(tài)學[2]、細胞學、同工酶學[3]以及分子標記[4]等方法。分子標記鑒定技術可從DNA水平上揭示雜交子代與父母本間的遺傳差異。SSR即簡單重復序列，其分布于整個基因組，多態(tài)性高，且呈共顯性遺傳，由此開發(fā)作為分子標記技術操作簡單，是雜種后代鑒定的常用手段。樊秀彩等應用SSR分子標記技術對山葡萄與河岸葡萄的雜種后代進行了成功鑒定[5]。朱駿馳等以SSR分子標記鑒定了玫瑰香與紅地球葡萄的雜交后代[6]。Martinez等運用SSR標記研究葡萄種內(nèi)或種間的多態(tài)性及雜交子代鑒定，均認為SSR標記特異性強[7-8]。本研究利用SSR標記對刺葡萄的F1代雜種進行真實性鑒定，旨在為提高刺葡萄雜交育種效率奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013年5月采用常規(guī)雜交方法，選擇刺葡萄與玫瑰香、金手指等歐亞種及歐美雜種葡萄品種雜交，共6個不同雜交組合，供試的親本及雜交實生后代的64個單株，栽植于湖南農(nóng)業(yè)大學葡萄基地，取幼嫩葉片保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 以葡萄嫩葉為材料進行基因組DNA的提取，由于葡萄尤其刺葡萄葉片富含有機酸、多酚、多糖等物質(zhì)，在參考Lian等改良CTAB法[9-10]的基礎上又進行了改進，選擇將CTAB提取液的pH值由8調(diào)至9.5，DNA質(zhì)量明顯提高。提取的DNA在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，使用Eppendorf公司生產(chǎn)的Bio-Photometerplus核酸定量儀檢測基因組DNA的濃度和純度，并將濃度稀釋至30 ng/μL。

1.2.2 SSR反應體系優(yōu)化、引物合成及PCR擴增 SSR反應體系從影響反應的5個因素：Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq酶濃度、模板DNA濃度、引物濃度進行正交試驗比較，篩選出最優(yōu)體系水平，即Mg2+2.0 mmol/L，dNTPs 0.1 mmol/L，Taq聚合酶 1 U/L，模板DNA 30 ng/L，引物 0.5 μmol/L。各個因素濃度梯度見表1。

表1 SSR反應體系中的因素水平

參考相關文獻[11-12]中所用引物，試驗所用15對SSR引物序列(表2)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，試驗采用20 μL反應體系：基因組DNA 30 ng，dNTPs(0.1 mmol/L)，引物(0.5 μmol/L)，Mg2+(2.0 mmol/L)，Taq聚合酶 1 U，10×buffer 2.0 μL。PCR反應程序為擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，51 ～ 61 ℃退火15 s，73 ℃ 延伸1 min，10個循環(huán)；89 ℃變性15 s，51～61 ℃退火15 s，73 ℃延伸1 min，23個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應在Applied Biosystems 9902 PCR儀上進行。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，用相機拍照記錄。

1.2.3 雜種SSR鑒定 利用15對SSR引物進行親本間的多態(tài)性分析，選擇擴增帶型清晰、穩(wěn)定、主帶明顯、雙親中表現(xiàn)出多態(tài)性的引物作為雜種鑒定的引物。每對引物重復試驗3次，以確保結果的準確性。

表2 SSR引物序列

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取

對雙親及64份雜交后代共70份材料的DNA濃度和純度進行檢測，所提取DNA的D260 nm/D280 nm值均介于1.7～1.9 之間。由圖1可知，使用改良方法提取的DNA為1條清晰完整的條帶，沒有明顯拖尾，無蛋白質(zhì)和RNA污染。表明改良的CTAB法提取的DNA完整，純度高，符合本試驗的要求。

2.2 引物篩選

將SSR引物組合在雙親中進行PCR擴增，引物在親本中檢測出的多態(tài)性條帶為1～2個。經(jīng)過多次重復，篩選出其中條帶清晰、穩(wěn)定的引物，最終確定了在雙親中均有多態(tài)性的VrZAG83和VrZAG62引物用于雜種后代的鑒定及驗證(圖2)。

2.3 雜種后代的SSR鑒定結果

根據(jù)引物篩選結果，分別選擇引物VrZAG83和VrZAG62對64株雜種后代進行鑒定，電泳結果見圖3、圖4。后代中能擴增出父母本特異性條帶的認定，為真實性雜種，因為SSR標記為共顯性標記。由圖3和圖4可知，泳道11、39只擴增出母本特異性條帶，均未擴增出父本特異性條帶，可能為母本自交后代；泳道42在使用引物VrZAG83時，除擴增出1條母本特異條帶外，還擴增出1條未知來源條帶，但在使用引物VrZAG62時，僅擴增出1條母本特異條帶，可能為外源花粉污染所致，或者為母本自交后代。64個F1雜交后代群體中出現(xiàn)包含有父母本特異條帶的個體共有60個，僅出現(xiàn)父本特異條帶的個體有1個(泳道22)，一共為61個。故試驗中檢測的64個后代植株中有61個雙親雜交后代，雜交成功率為95.3%。

對于檢測出來的雜交成功的后代植株進行了田間形態(tài)學性狀觀察，這些雜交后代在葉片特征、枝條顏色、果實性狀及風味都帶有明顯的父本特征，表明父本基因型已經(jīng)進入子代基因組中，也進一步驗證了分子鑒定結果的準確性。

3 討論與結論

種間雜交是獲得植物新品種的重要途徑，通過種間雜交可以聚合雙親的優(yōu)點，對雜種后代進行早期鑒定與選擇是雜交育種中提高育種效率一個重要環(huán)節(jié)。實際應用中大多數(shù)僅通過形態(tài)學觀察，辨別雜種后代是否雜交成功，但鑒定結果的準確性并不高。SSR標記為共顯性標記[13]，能夠區(qū)分雜合位點和純合位點，并且重復性及穩(wěn)定性好，試驗操作簡單，已成功應用于玉米[14]、水稻[15]、大豆[16]等植物的雜交種鑒定，目前在葡萄的染色體上已定位了753個SSR標記[17]，為葡萄雜種純度的鑒定提供了理論依據(jù)。

本試驗從15對引物中篩選出2對擴增帶型清晰、穩(wěn)定、具有父母本特異性條帶的引物VrZAG83和VrZAG62，對刺葡萄雜交后代進行了真實性鑒定，2對引物鑒定結果一致，共有61 個后代因具有父本特異性條帶而被鑒定為雙親雜交后代，

而其他3個后代可能是母本自交后代，或受外源花粉污染所致。另外為了更準確地對刺葡萄雜交后代進行鑒定，對雜交后代進行田間形態(tài)學觀察，結果表明，鑒定出的雜交成功的后代在葉片、枝條、果實等方面都具有明顯的父本特征，而其他3個后代在形態(tài)特征上則與母本無顯著差異。

本試驗中，田間形態(tài)學觀察結果與分子鑒定結果基本一致，證明SSR標記可以有效地對葡萄屬種間雜交后代進行真實性鑒定，可用作葡萄屬種間種質(zhì)創(chuàng)新的有效輔助手段；綜合田間形態(tài)學觀察及SSR分子標記技術鑒定結果確定64個后代植株中有61個為真實雙親雜交后代，其結合了父母本的共有特征，本研究鑒定出的雜交成功的后代可以用于構建葡萄的分子遺傳圖譜及對重要性狀進行QTL定位，從而為刺葡萄的分子標記輔助育種研究打下重要基礎。