路 遙， 周 東， 鄭銀英

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子 832003

新疆加工番茄病毒病日益嚴重，通過田間病毒檢測發(fā)現(xiàn)馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，簡稱PVY)和南方番茄病毒(southern tomato virus，簡稱STV)是造成新疆加工番茄病害的主要病毒，極大地減少了加工番茄的產(chǎn)量。馬鈴薯Y病毒是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的典型成員，根據(jù)寄主、生物學(xué)癥狀、基因組序列以及血清學(xué)特征可將PVY分為普通株系(common or ordinary strain)PVYO、煙草葉脈壞死株系(tobacco veinal necrosis strain)PVYN、馬鈴薯點刻條斑株系(potato stipple streak strain)PVYC、PVYZ以及PVYO和PVYN的重組株系PVYNTN、PVYN：O和PVYN-Wi[1]。梁學(xué)超等通過血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，新疆加工番茄上PVYO、PVYO/N/C、PVYN檢出率分別為20%、18.05%、0，且PVY不同株系總檢出率達到24.9%，表明新疆加工番茄上PVY主要為PVYN：O株系和PVYO株系[2]。PVY為單鏈正義RNA病毒，只包含1個開放閱讀框(ORF)，翻譯成1個大的多聚蛋白，再利用蛋白酶將其加工成11個多功能蛋白(P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb、CP)[3-4]。HC-Pro 是馬鈴薯Y病毒重要的多功能蛋白，可以影響病毒生活史的多個方面，它具有HC-Pro/P3特異切割位點識別功能，在病毒基因組翻譯、蛋白加工中發(fā)揮重要作用，同時參與病毒的復(fù)制和癥狀表達，促進病毒在植物體內(nèi)細胞間移動和系統(tǒng)移動，抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默和病毒誘導(dǎo)的基因沉默[5-6]。南方番茄病毒是一種雙鏈RNA(dsRNA)病毒，其基因組核苷酸序列全長為3 437 nt，含有2個部分重疊的開放閱讀框，推測ORF1編碼377個氨基酸的外殼蛋白(CP)，而ORF2編碼762個氨基酸的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)[7-9]。STV為種傳病毒，尚未發(fā)現(xiàn)其他傳播機制，目前，對于STV的研究還處于初期階段，對于其侵染番茄植株的分子機制及侵染癥狀尚不了解。酵母雙雜交系統(tǒng)是植物病毒學(xué)研究中的重要手段，主要應(yīng)用于病毒蛋白與寄主編碼蛋白相互作用的研究，可以通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與PVYHC-Pro和STVRdRp基因相關(guān)的加工番茄內(nèi)源基因。由于酵母雙雜交系統(tǒng)可能出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，所以需要進行誘餌載體自激活試驗，本研究利用以Sos恢復(fù)系統(tǒng)(一種不依賴轉(zhuǎn)錄激活機制的酵母雙雜交系統(tǒng))為原理的胞質(zhì)酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建PVYHC-Pro和STVRdRp基因的誘餌載體，并在酵母中進行自激活檢測及毒性分析，為從加工番茄cDNA文庫中篩選與PVYHC-Pro和STVRdRp互作的寄主因子以及研究PVY和STV的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑 溫度敏感酵母突變株cdc25H、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α為筆者所在實驗室保存。質(zhì)粒pSos、pSos MAFB、pMyr MAFB、pMyr LaminC、pSos ColⅠ、pMyr SB，均購自Stratagene公司；T4DNA連接酶及PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購于Promega公司；試驗所需內(nèi)切酶購自Fermentas公司；氨基酸、酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 基因與引物 根據(jù)筆者所在實驗室已獲得的PVY[2]和STV基因組全長序列設(shè)計引物，結(jié)合酵母表達載體pSos的閱讀框和多克隆位點，在PVYHC-Pro上下游引物的5′端分別引入BamHⅠ/SalⅠ酶切位點，在STVRdRp上下游引物的5′端分別引入SalⅠ/SacⅠ酶切位點(表1)。引物合成和序列測定均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 以筆者所在實驗室已經(jīng)克隆、測序的pGEM-T-PVY HC-Pro及pGEM-T-STV質(zhì)粒DNA為模板，利用引物HC-Pro F/HC-Pro R、RdRp F/RdRp R分別擴增HC-Pro和RdRp，擴增結(jié)束后，將5 μL PCR產(chǎn)物進行電泳，對剩下的擴增產(chǎn)物進行回收。

1.2.2 克隆載體和誘餌載體的構(gòu)建與鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后與pGEM-T載體于4 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化EscherichiacoliDH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，37 ℃搖菌16 h，提取質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定正確的克隆載體進行測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pGEM-HCPro、pGEM-RdRp分別用BamHⅠ/SalⅠ、SalⅠ/SacⅠ雙酶切，同時用相同的酶消化酵母誘餌載體pSos，回收目的片段，用T4DNA連接酶于4 ℃連接過夜，構(gòu)建pSosHC-Pro、pSos-RdRp載體。

表1 試驗所用的引物及序列

注：下劃線表示在相應(yīng)引物5′端引入酶切位點的序列位置。

1.2.3 酵母菌株cdc25H表型的驗證 將Stratagene公司CytoTrap XR Library Construction Kit中的酵母菌株cdc25H劃線于YPAD平板，分別于25、37 ℃孵育6 d，同時將酵母菌株cdc25H在4種單營養(yǎng)缺陷型[尿嘧啶缺陷型(Ura-)、亮氨酸缺陷型(Leu-)、色氨酸缺陷型(Trp-)、組氨酸缺陷型(His-)]SD/Glu培養(yǎng)基(指含有葡萄糖的SD培養(yǎng)基)平板上劃線，在25 ℃下培養(yǎng)6 d，觀察結(jié)果。

1.2.4 共轉(zhuǎn)化及誘餌蛋白轉(zhuǎn)錄自激活活性的檢測 將表2的不同質(zhì)粒組合分別加入酵母感受態(tài)細胞中并混勻，再按照Stratagene公司CytoTrap XR Library Construction Kit所提供的方法進行共轉(zhuǎn)化與激活作用檢測試驗。分別將10、100 μL轉(zhuǎn)化酵母菌液涂布于SD/Glu (-UL)平板上，于 25 ℃ 培養(yǎng) 5 d，計算酵母感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率，并將剩余轉(zhuǎn)化酵母菌液1(對應(yīng)表2中的第1組)涂布于SD/Glu(-UL)平板上，于 37 ℃ 培養(yǎng)6 d，觀察是否發(fā)生溫敏回復(fù)。分別將轉(zhuǎn)化酵母菌液2～9(對應(yīng)表2中的第2～9組)涂布于SD/Glu(Leu-、Ura-、-UL)平板上，25 ℃培養(yǎng)5 d后，隨機挑取3個單菌菌落，分別用25 μL無菌水混勻，再分別取 2.5 μL 菌液劃線于2個 SD/Glu(-UL) 和2個SD/Gal(-UL)平板上，每種平板分別放置于25、37 ℃下培養(yǎng)5 d，觀察溫度對菌落生長的影響。

表2 誘餌蛋白和對照檢測質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化組配

注：“-UL”指缺失尿嘧啶、亮氨酸2種氨基酸。下同。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆載體與誘餌載體的構(gòu)建及鑒定

通過PCR擴增、克隆獲得1 398 bp PVYHC-Pro和2 286 bp STVRdRp基因，并將相應(yīng)的目的片段連接pSos，成功構(gòu)建pSosHC-Pro和pSos-RdRp載體(圖1)。

2.2 酵母菌株cdc25H表型的驗證

將酵母菌株cdc25H在YPAD平板上劃線，分別在25、37 ℃ 培養(yǎng)6 d。在25 ℃時菌落生長正常，在37 ℃時無菌落生成。同時，將酵母菌株cdc25H在4種單營養(yǎng)缺陷型(-Ura、-Leu、-Trp、-His)SD/Glu平板上劃線，于25 ℃培養(yǎng)6 d，結(jié)果在4種單氨基酸營養(yǎng)缺陷型的平板上均不生長。結(jié)果表明，酵母菌株cdc25H表型正常，沒有發(fā)生溫度敏感回復(fù)突變，可用于后續(xù)試驗。

2.3 酵母感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化效率的計算

取75 μL酵母感受態(tài)細胞涂布于YPAD平板上，于37 ℃孵育 6 d 后發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)酵母菌落，表明未發(fā)生溫度敏感回復(fù)突變，可用于后續(xù)試驗，根據(jù)表2中轉(zhuǎn)化酵母菌液1可計算出酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率為6.14×103/μg，將剩余轉(zhuǎn)化酵母菌液1涂布于SD/Glu(-UL)平板上，于37 ℃孵育6 d，未發(fā)現(xiàn)酵母菌落生長，表明沒有溫敏回復(fù)發(fā)生，說明所制備的酵母感受態(tài)可用于酵母雙雜交試驗。

2.4 誘餌蛋白自激活作用的檢測

將測序后證明構(gòu)建正確的誘餌載體pSosHC-Pro及pSOS-RdRp按照表2中的配比轉(zhuǎn)入制備好的cdc25H酵母感受態(tài)細胞后，發(fā)現(xiàn)25 ℃時均能夠在SD/Glucose(-UL)平板上正常生長，分別隨機挑取3個單菌落分別劃線于2個 SD/Glu(-UL) 和2個SD/Gal(-UL)平板上，每種平板分別放置在25、37 ℃下培養(yǎng)5 d，對于誘餌蛋白pSosHC-Pro及 pSos-RdRp，在25 ℃時每種組合在SD/Glu(-UL)和SD/Gal(-UL)平板上均能生長，現(xiàn)象正常；在37 ℃時SD/Glu(-UL)平板上均不生長，在SD/Gal(-UL)平板上①、③、⑤生長現(xiàn)象正常，結(jié)果表明誘餌蛋白pSos-HcPro及pSOS-RdRp沒有自激活作用(圖2)，因此可見2種誘餌載體適用于該酵母雙雜交系統(tǒng)，可以進行后續(xù)的cDNA文庫篩選。

3 討論

新疆由于水土光熱資源豐富，使得加工番茄成為該地的主要經(jīng)濟作物。近年來，由于受栽培模式及氣候等客觀因素的影響，使得病毒病得以蔓延。通過對新疆加工番茄田間病毒檢測發(fā)現(xiàn)，新疆加工番茄病毒病主要有CMV、ToMV、PVY、STV，這表明STV也已成為加工番茄種植不容忽視的主要病毒[10-11]。本研究將PVY、STV作為新疆加工番茄主要原有病毒以及新興的主要病毒，研究PVY、STV與加工番茄的相互作用以及揭示其致病機制尤為重要。

酵母雙雜交技術(shù)是在真核細胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄中進行的一種高效敏感的研究蛋白與蛋白之間相互關(guān)系的技術(shù)[12]。近年來，酵母雙雜交技術(shù)已成為植物病毒學(xué)研究中的主要手段，廣泛應(yīng)用于研究植物病毒蛋白與寄主編碼蛋白之間的相互作用，大量應(yīng)用于篩選與已知蛋白的候選互補蛋白或驗證蛋白間相互作用方面[13-14]。研究認為，HC-Pro在病毒侵染過程中起至關(guān)重要的作用，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選加工番茄中與PVY HC-Pro互作的寄主因子，將有可能從加工番茄中分離鑒定出參與病毒沉默的寄主因子基因，有助于加工番茄防治病毒病的研究。STV作為新興的加工番茄主要病毒，其侵染加工番茄的分子機制尚不清楚，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與 STV-RdRp互作的寄主基因，將有可能弄清STV侵染植物的機制，為研究STV提供基礎(chǔ)。

在利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選文庫驗證及蛋白質(zhì)間相互作用的過程中，誘餌蛋白的正確表達至關(guān)重要，一方面由于某些蛋白的表達可能會對酵母菌株有毒害作用，使其不能夠在選擇培養(yǎng)基上進行生長，影響后續(xù)篩選工作，另一方面某些誘餌蛋白本身就具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，這些蛋白能夠激活報告基因，使其能夠表達，造成假陽性現(xiàn)象，因此，要進行誘餌載體的自激活和毒性驗證，以此排除假陽性和假陰性現(xiàn)象。本研究構(gòu)建了PVYHC-Pro和STV-RdRp基因的誘餌載體，通過研究顯示這2個誘餌載體均無毒性或自激活作用，因此，構(gòu)建完成的誘餌載體符合本試驗的需要，為下一步從加工番茄cDNA文庫中篩選與HC-Pro和RdRp相互作用的蛋白奠定了基礎(chǔ)。