血清乙型肝炎病毒-DNA載量對乙型肝炎患者肝功能及外周血內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)指標的影響研究

劉芳，閆宇，李雅楠，戴亮，肖永紅*

乙型肝炎病毒（HBV）感染是我國最嚴峻的公共衛(wèi)生問題之一。我國目前約有HBV感染者7 000多萬，乙型肝炎（以下簡稱乙肝）患者2 000萬～3 000萬［1］，若不給予有效的治療，25%～40%的慢性乙肝患者會進展為肝硬化或原發(fā)性肝癌甚至死亡［2］。而HBV-DNA載量是預測HBV感染最直接且特異度、靈敏度高的指標；肝功能指標可以在一定程度上反映肝臟的損傷程度；且有研究表明，HBV感染可誘導肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）［3］。為此，本研究選取唐山市傳染病醫(yī)院乙肝患者及非HBV感染患者，比較不同血清HBVDNA載量乙肝患者的肝功能及外周血ERS相關(guān)指標變化，分析血清HBV-DNA載量對肝功能及ERS的影響，為乙肝的臨床診治提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年7月—2017年6月在唐山市傳染病醫(yī)院治療的乙肝患者136例。其中男71例，女65例，男女比例為1∶0.9；年齡18～70歲，平均（39.8±11.9）歲。按血清HBV-DNA載量將患者分為陰性組（血清HBV-DNA載量＜1.0×103copies/ml）、低拷貝組（1.0×103copies/ml≤血清HBV-DNA載量＜1.0×105copies/ml）、中拷貝組（1.0×105copies/ml≤血清HBV-DNA載量＜1.0×107copies/ml）、高拷貝組（血清HBV-DNA載量≥1.0×107copies/ml）［4］。納入標準：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》［5］中的診斷標準。排除標準：（1）合并甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒感染者；（2）合并脂肪肝、代謝性肝病、自身免疫性肝炎、酒精性肝病者；（3）有心、肺、腦、腎等嚴重疾病者；（4）合并其他惡性腫瘤者；（5）合并其他自身免疫性疾病者。

同期選取在唐山市傳染病醫(yī)院治療的非HBV感染患者82例為對照組。其中男45例，女37例，男女比例為1∶0.8；年齡18～77歲，平均（39.2±12.2）歲。納入標準：非HBV感染的新入院患者。排除標準：同乙肝患者的排除標準。

所有研究對象簽署知情同意書，本研究經(jīng)華北理工大學醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者一般資料，包括性別、年齡。

1.2.2 血液標本采集 抽取患者入院當天清晨空腹靜脈血5 ml，全血標本室溫放置2 h或4 ℃冰箱過夜后3 000 r/min離心20 min（離心半徑10 cm），取上清液，置于-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 血清HBV-DNA載量檢測 取500 μl血清至1.5 ml滅菌離心管，再取100 μl血清加入等量的DNA濃縮液（中山大學達安基因股份有限公司）至1.0 ml的滅菌離心管內(nèi)，震蕩混勻5 s，6 000 r/min離心20 s（離心半徑10 cm），去上清液，加入30 μl的DNA提取液，靜置30 min后，震蕩5～10 s，放入100 ℃的恒溫箱中保溫10 min，10 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），使用ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）擴增，使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司，本試劑盒的最低檢出限濃度為30 copies/ml，最低定量濃度為100 copies/ml）、PCR-熒光探針法檢測血清HBV-DNA載量。

1.2.3.2 肝功能指標檢測 采用Hitachi 7170全自動生化儀（日本日立公司）檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶（ALP），嚴格按照儀器說明書操作。

1.2.3.3 ERS相關(guān)指標檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測ERS相關(guān)指標——葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白（CHOP）、天冬半胱氨酸特異性蛋白酶-12（caspase-12），ELISA試劑盒由北京冬歌生物科技有限公司提供，按試劑盒說明書操作，具體步驟如下：（1）將所需板條在室溫下平衡20 min；（2）設置標準品孔和樣品孔，標準品孔加不同濃度的標準品50 μl；（3）樣品孔先加待測樣品10 μl，再加樣本稀釋液40 μl，空白孔不加；（4）除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μl，封固，37 ℃溫育60 min；（5）洗板5次；（6）每孔加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；（7）每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)在450 nm波長處用SpectraMax M5酶標儀（美國BioTek公司）測定各孔的OD值。以試劑盒中不同濃度的標準品的OD值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制出標準濃度曲線，按曲線方程計算各樣本水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Excel 2013建立數(shù)據(jù)庫，應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；兩變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組血清HBV-DNA載量分別為（185.0±145.7）、（1.8×104±2.7×104）、（2.5×106±2.7×106）、（3.0×108±1.8×108）copies/ml，患者例數(shù)分別為 42、33、29、32例。5組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 5組肝功能指標比較 5組ALT、AST、γ-GT比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；5組ALP比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于對照組、陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于低拷貝組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高拷貝組ALT、AST高于中拷貝組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組γ-GT高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

表1 5組一般資料比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of general data in each group

表2 5組肝功能指標比較（x±s，U/L）Table 2 Comparison of liver function indexes in each group

2.3 5組ERS相關(guān)指標比較 5組GRP78、CHOP、caspase-12比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組GRP78、CHOP、caspase-12高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低拷貝組GRP78低于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中拷貝組GRP78高于低拷貝組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 5組ERS相關(guān)指標比較（x±s）Table 3 Comparison of ERS related indexes in each group

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 肝功能指標與血清HBV-DNA載量相關(guān)性分析ALT、AST與血清HBV-DNA載量均呈正相關(guān)（P＜0.05）；γ-GT、ALP與血清HBV-DNA載量無直線相關(guān)關(guān)系（P＞0.05，見表4）。

2.4.2 肝功能指標與ERS相關(guān)指標相關(guān)性分析 ALT、AST、γ-GT、ALP與GRP78、CHOP、caspase-12均無直線相關(guān)關(guān)系（P＞0.05，見表4）。

表4 肝功能指標與血清HBV-DNA載量及ERS相關(guān)指標的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between liver function and HBV-DNA load and ERS indexes

3 討論

病毒性肝炎位居我國傳染病發(fā)病率之首，原國家衛(wèi)計委數(shù)據(jù)顯示，乙肝患者占所有肝炎患者的80%，我國每年因乙肝所致直接經(jīng)濟損失至少500億元［6］。乙肝的發(fā)病機制尚不十分明確，現(xiàn)階段研究表明，其發(fā)病機制主要是HBV的不斷復制、持續(xù)表達和釋放抗原引起肝細胞的持續(xù)性炎性反應，導致纖維組織持續(xù)增生，使肝細胞纖維化，最終導致肝硬化［7］。若不接受及時有效的治療，25%～40%的慢性乙肝患者可進展為肝硬化或原發(fā)性肝癌并最終導致死亡［2］。研究顯示，多種疾病的發(fā)生均與ERS有關(guān)，而肝細胞中含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，許多肝臟疾病如病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、非酒精性脂肪肝等的發(fā)病機制均涉及ERS［8］。因此，本研究比較不同血清HBV-DNA載量乙肝患者的肝功能及外周血ERS相關(guān)指標變化，分析血清HBV-DNA載量對肝功能及外周血ERS相關(guān)指標的影響，以期為乙肝的臨床診治提供借鑒。

血清HBV-DNA陽性提示HBV復制和有傳染性。血清HBV-DNA載量越高表示病毒復制越厲害，傳染性越強。血清HBV-DNA載量及ALT等指標均是反映乙肝患者肝功能的重要指標［9］。本研究結(jié)果顯示，低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于對照組、陰性組，中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于低拷貝組，高拷貝組ALT、AST高于中拷貝組；陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組γ-GT高于對照組；5組ALP無差異。表明HBV的復制確實會在一定程度上影響肝功能，這與相關(guān)研究結(jié)果一致［10］。分析其原因可能為HBV感染會引起肝細胞損傷，而目前關(guān)于其機制的研究有以下兩種觀點：（1）肝細胞表面HBV抗原可引起人體的免疫應答，造成肝細胞損傷；（2）病毒大量復制造成其中間產(chǎn)物在細胞內(nèi)累積，引發(fā)肝細胞損傷［11］。本研究結(jié)果亦顯示，ALT、AST與血清HBVDNA載量均呈正相關(guān)，但其相關(guān)程度并不是很強（r值均＜0.500），而γ-GT、ALP與血清HBV-DNA載量無直線相關(guān)關(guān)系，可能與在分析過程中未將乙肝患者按臨床分期分組統(tǒng)計有關(guān)，這需要后續(xù)研究進一步完善。

ERS通過誘導CHOP表達、GRP78及caspase-12的活化等一系列生物學效應信號使細胞由生存向凋亡轉(zhuǎn)變。GRP78的迅速升高被認為是ERS最敏感的指標［12］。CHOP是聯(lián)系ERS與細胞凋亡的重要中間信號分子，caspase-12僅在ERS時被活化，是介導ERS凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，是ERS特有的凋亡途徑［13］。既往體外實驗及動物實驗表明，HBV可誘導肝細胞發(fā)生ERS［14-15］，但是相關(guān)臨床試驗甚少［16］。本研究結(jié)果顯示，陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組GRP78、CHOP、caspase-12高于對照組，這進一步在人體中證明了HBV可誘發(fā)ERS。但是本研究發(fā)現(xiàn)ALT、AST、γ-GT、ALP與GRP78、CHOP、caspase-12均無直線相關(guān)關(guān)系，分析這一結(jié)果的原因可能為ERS相關(guān)指標反映的是肝細胞的凋亡，而病毒復制的程度與肝細胞的凋亡進程并不一致。HBV感染的病程可分為4個階段，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動期及再活躍期。在免疫耐受期，血清HBV-DNA復制活躍，肝組織學無明顯異?；騼H有輕度異常；在免疫清除期，免疫耐受消失進入免疫活躍期，血清HBV-DNA載量下降，肝組織開始出現(xiàn)炎性壞死等；進入非活動期后，檢測不到血清HBV-DNA載量或血清HBV-DNA載量低于檢測下限，肝細胞壞死及炎癥可緩解；部分患者會進入再活躍期，導致血清HBVDNA載量再次上升。

綜上所述，乙肝患者血清HBV-DNA載量可對肝功能產(chǎn)生影響，且可誘發(fā)外周血ERS，這對乙肝的發(fā)病機制研究及臨床診治有一定的現(xiàn)實指導意義。但是，本研究所納入的樣本量有限，且僅對外周血ERS相關(guān)指標進行了檢測，在今后的研究中可擴大樣本量，對乙肝患者進行更為細致的分期研究，并檢測肝組織中ERS相關(guān)指標的表達，以彌補本研究的不足之處，進一步探索ERS在乙肝發(fā)病及進展中的作用。

志謝：感謝唐山市傳染病醫(yī)院劉福忠、李小林老師在數(shù)據(jù)收集及標本采集過程中給予的幫助與支持。