【作 者】陳海波，方麗，喻炎，馬鳳森

1 浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，杭州市，310018 2 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，生物制劑與材料實(shí)驗(yàn)室，杭州市，310014

0 引言

隨著可吸收生物材料的蓬勃發(fā)展，越來(lái)越多的生物醫(yī)用可降解材料進(jìn)入人們的視野，大體包括纖維素類、殼聚糖、透明質(zhì)酸、淀粉、海藻酸鹽等多糖與膠原等天然高分子材料，脂肪聚酯、聚原酸酯、聚碳酸酯、生物合成聚酯等合成高分子材料，以及生物陶瓷、生物醫(yī)用金屬材料等[1-3]。其中，纖維素類因其來(lái)源廣泛，可在體內(nèi)降解吸收，生物相容性好，廣泛應(yīng)用于藥物緩釋載體[4]、醫(yī)療器械[5-6]及組織工程[7-8]等醫(yī)藥領(lǐng)域。

天然纖維素材料強(qiáng)度高，難以被大多數(shù)有機(jī)體所消化，但纖維素經(jīng)再生或改性處理后，穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)被破壞，可被生物體吸收[9-11]。氧化再生纖維素產(chǎn)品用于手術(shù)過(guò)程中當(dāng)常規(guī)止血方法無(wú)效時(shí)，用來(lái)輔助毛細(xì)血管、靜脈及小動(dòng)脈的止血[12]。但氧化再生纖維素在臨床應(yīng)用中，不完全吸收和過(guò)敏反應(yīng)等不良反應(yīng)[13-14]時(shí)有發(fā)生。

目前，氧化再生纖維素產(chǎn)品的報(bào)道多集中在體內(nèi)及臨床應(yīng)用方面。本研究選取上市產(chǎn)品速即紗作為研究對(duì)象，報(bào)道了一種采用凝膠色譜法測(cè)定降解產(chǎn)物分子量的變化[15-16]，監(jiān)控速即紗降解過(guò)程的方法，為氧化再生纖維素產(chǎn)品的降解終點(diǎn)的判斷提供新的思路。同時(shí)建立了采用親水作用液相色譜（HILIC）與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）聯(lián)用分析降解產(chǎn)物含量的方法[17]，為氧化再生纖維素類產(chǎn)品的降解產(chǎn)物研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器

所用儀器為：Waters 1525液相色譜儀，包括在線真空脫氣機(jī)，四元泵自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；Waters 2414示差折光檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Nicolet 6700 傅立葉變換紅外光譜儀（美國(guó)熱電尼高力公司）；S-4700 掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；FA1604S電子微量天平(上海天平儀器廠）；FreeZone 6冷凍干燥機(jī)（Labconco，美國(guó)）；Aglient 1260色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司）；Alltech 3300 ELSD（美國(guó)奧泰公司）。

1.2 試劑

所用試劑為：速即紗（規(guī)格7.5 cm×10 cm，美國(guó)強(qiáng)生公司）；透析袋（美國(guó)Viskase）；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司）；注射級(jí)無(wú)水葡萄糖（濰坊盛泰藥業(yè)有限公司）；D-葡萄糖醛酸（aladdin?）；D-纖維二糖（aladdin?）；30%過(guò)氧化氫（永華化學(xué)科技有限公司）；甲酸銨（江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司）；硝酸鈉（上海振欣試劑廠）；乙腈（TEDIA?）；甲酸（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 材料降解及降解產(chǎn)物的凍干

取速即紗可吸收止血紗布（約0.50 g），裝入煮沸處理的透析袋內(nèi)，向透析袋內(nèi)加入現(xiàn)配的3%過(guò)氧化氫溶液，排除氣泡。將上述透析袋分別放入含有120 mL 3%過(guò)氧化氫溶液的燒杯內(nèi)，置于恒溫震蕩箱中（37 ℃、100 rpm），每48 h以100 mL新配制的3%過(guò)氧化氫溶液更換燒杯內(nèi)相同體積的溶液[18]。待到設(shè)定時(shí)間點(diǎn)后，將燒杯內(nèi)降解液冷凍干燥，得降解產(chǎn)物凍干粉；將透析袋內(nèi)殘留降解物取出，冷凍干燥，得殘留速即紗降解物凍干物。

1.4 氧化再生纖維素降解前后結(jié)構(gòu)形態(tài)表征

1.4.1 紅外光譜分析

將速即紗和降解第4 d后透析袋內(nèi)的殘留速即紗降解物凍干物，分別剪碎后與KBr混合、研磨、壓片，得測(cè)試樣品[19]。在掃描范圍為0～4 000 cm-1，采用Nicolet 6700 型FT-IR光譜儀分析降解前后的結(jié)構(gòu)變化。

1.4.2 掃描電子顯微鏡觀察

取速即紗及速即紗的纖維絲，分別用導(dǎo)電膠粘在鋁箔圓形載物片上；透析袋內(nèi)降解物的凍干產(chǎn)物，研磨成粉末撒在導(dǎo)電膠上，用洗耳球吹掃掉導(dǎo)電膠上未粘緊的粉末。將上述制備樣品置于鋁箔圓形載物片上，噴金5 min，放入掃描電子顯微鏡中掃描[20]。

1.5 降解產(chǎn)物分子量分析

1.5.1 GPC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（峰尖分子量為Mp=180 D，3 400 D，20 400 D，36 700 D，55 600 D，81 000 D）做為標(biāo)樣，以峰尖分子量log(Mw)和淋出體積V繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 降解產(chǎn)物分子量測(cè)定

取第4 d、6 d、8 d、10 d、12 d的透析袋內(nèi)樣品，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，測(cè)定不同降解時(shí)間點(diǎn)的分子量信息。

1.6 降解產(chǎn)物的含量分析

1.6.1 溶液配制

葡萄糖對(duì)照溶液配制：精密稱取葡萄糖0.010 28 g，加10 mL純化水溶解，用乙腈定容至50 mL，即得。

纖維二糖對(duì)照溶液配制：精密稱取纖維二糖0.010 16 g，加10 mL純化水溶解，用乙腈定容至50 mL，即得。

葡萄糖醛酸對(duì)照溶液配制：精密稱取葡萄糖醛酸0.010 40 g，加10 mL純化水溶解，用乙腈定容至50 mL，即得。

樣品溶液配制：精密稱取降解產(chǎn)物凍干粉0.100 88 g，加2 mL純化水溶解，用乙腈定容至10 mL，即得。

所有進(jìn)樣溶液均經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾。

1.6.2 色譜條件[21]

色譜柱，XAmide（4.6 mm×250 mm，P/N 19170510525，S/N 13070108V）；ELSD漂移管溫度，45 ℃；增益，1；氮?dú)饬魉伲?.5 L/min；流動(dòng)相，有機(jī)相-水相（乙腈-pH 5.5的5 mmol/L甲酸銨緩沖液）；流速，1 mL/min；柱溫，30 ℃；色譜工作站，ChemStation。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖對(duì)照溶液、纖維二糖對(duì)照溶液、葡萄糖醛酸對(duì)照溶液進(jìn)樣不同體積，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)與峰面積的自然對(duì)數(shù)求得線性方程。

1.6.4 葡萄糖、纖維二糖與葡萄糖醛的含量測(cè)定

分別將對(duì)照溶液及樣品溶液進(jìn)樣20 μL，測(cè)定樣品中的葡萄糖、纖維二糖與葡萄糖醛酸。

2 結(jié)果

2.1 GPC標(biāo)準(zhǔn)曲線

按方法“1.5.1”所述，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)定曲線方程：log(Mw)=S-2.35V+0.168V2-0.005 34V3，R=0.999 993。

2.2 GPC分析降解產(chǎn)物的分子量信息

第4 d、6 d、8 d、10 d、12 d的透析袋內(nèi)降解液的分子量信息，如表1所示。

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，隨著時(shí)間的變化，透析袋內(nèi)降解產(chǎn)物的分子量（除了Mw）呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在第10 d、和第12 d時(shí)變化趨于平穩(wěn)，下降趨勢(shì)呈現(xiàn)平臺(tái)期，可以推斷出速即紗在該條件下的完全降解時(shí)間約為10～12 d。

表 1 不同時(shí)間點(diǎn)降解產(chǎn)物的分子量信息，n=3Tab.1 The molecular weight of degradation products at diあerent time，n=3

2.3 氧化再生纖維素降解前后結(jié)構(gòu)形態(tài)表征

2.3.1 紅外光譜分析

對(duì)比圖1中a、b對(duì)應(yīng)的紅外譜圖可以看出，降解前的樣品和降解后的紅外譜圖并無(wú)較大差異，只有幾個(gè)單元發(fā)生了變化。可能的原因是：3%過(guò)氧化氫溶液的氧化作用較弱，材料的降解主要是高分子鏈的斷裂，聚合物沒有產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)，或已發(fā)生輕微的結(jié)構(gòu)變化但尚未達(dá)到紅外光譜的檢測(cè)限；關(guān)于3%的雙氧水溶液對(duì)纖維素中單體的結(jié)構(gòu)影響以及降解產(chǎn)物種類和含量尚需進(jìn)一步研究與分析。

2.3.2 掃描電子顯微鏡觀察

由圖2～圖4可知，速即紗可吸收止血紗布降解前，纖維表面較為光滑，纖維的編織結(jié)構(gòu)完整，沒有纖維斷裂的現(xiàn)象（圖2、圖3）；速即紗可吸收止血紗布經(jīng)過(guò)降解后，纖維的整體編織結(jié)構(gòu)完全破壞，說(shuō)明透析袋外的降解產(chǎn)物完全，并且表面有腐蝕的小孔結(jié)構(gòu)（圖4）。表明該類材料隨著降解過(guò)程的發(fā)生，表面形態(tài)發(fā)生很大變化。

2.4 降解產(chǎn)物中葡萄糖、纖維二糖與葡萄糖醛酸的含量測(cè)定

由表2可知，氧化再生纖維素產(chǎn)品的降解產(chǎn)物中存在葡萄糖與纖維二糖，但含量比較低，其中葡萄糖含量為0.13%，纖維二糖含量為0.17%。而在當(dāng)前檢測(cè)條件下樣品中沒有檢測(cè)到葡萄糖醛酸，可能是由于在該降解條件下氧化再生纖維素降解生成其他可溶性的寡聚糖。

圖2 速即紗降解前纖維表面電鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM images of fiber surface before degradation of SURGICEL

圖3 速即紗降解前織物編織結(jié)構(gòu)Fig.3 SEM images of braided structure before degradation of SURGICEL

圖4 速即紗降解產(chǎn)物表面結(jié)構(gòu)Fig.4 SEM images of braided structure after degradation of SURGICEL

3 討論

（1）掃描電鏡多用于檢測(cè)樣品的形貌和組成，掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)降解前后表面形態(tài)發(fā)生較大變化，但降解前后的紅外譜圖卻并無(wú)明顯差異。分析原因可能是：在3%過(guò)氧化氫溶液的氧化環(huán)境下，降解主要是高分子鏈的斷裂，官能團(tuán)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生較大變化。

表2 降解產(chǎn)物中葡萄糖、纖維二糖和葡萄糖醛酸的含量，n=3Tab.2 The content of glucose, fiber disaccharide and glucuronic acid in degradation products，n=3

（2）目前，用來(lái)判斷氧化再生纖維素的降解終點(diǎn)，一般采用目測(cè)法和失重法[22]，而本研究通過(guò)采用GPC測(cè)定不同降解時(shí)間時(shí)降解產(chǎn)物的分子量變化[23-24]，測(cè)定速即紗的降解終點(diǎn)為10 d，該結(jié)果也與梅昕等[19]研究結(jié)果一致。

（3）HILIC對(duì)強(qiáng)極性物質(zhì)有更大保留，適于分析單糖、二糖和低聚糖[25]，而ELSD對(duì)不揮發(fā)的溶質(zhì)靈敏度高，也適于分析糖類[26]。氧化再生纖維素的最終降解產(chǎn)物中的葡萄糖含量為0.13%，纖維二糖含量為0.17%。

（4）氧化再生纖維素在降解過(guò)程初始階段，發(fā)生高分子鏈的斷裂，隨著降解不斷進(jìn)行，降解產(chǎn)物逐漸變?yōu)椴煌肿恿康钠暇厶荹27]，并最終降解為葡萄糖及其衍生物。氧化再生纖維素降解終點(diǎn)判斷，其降解產(chǎn)物組分的分子量分布位于Mp 3 000～13 000之間。因此，其組分為平均聚合度在19～67之間的葡聚糖，而氧化再生纖維素的最終降解產(chǎn)物則含有小分子的葡萄糖和纖維二糖。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)氧化再生纖維素的降解產(chǎn)物分析，確證了其最終降解產(chǎn)物含有葡萄糖和纖維二糖。同時(shí)還建立了一種新的判斷氧化再生纖維素的降解終點(diǎn)的方法，也為可吸收類產(chǎn)品的降解終點(diǎn)判斷提供新的選擇和參考。