基于程序升溫GC的EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)在氮、 碳和硫同位素組成測定中的應用

孟憲菁，楊 斌，馬 瀟，張宏博，徐 波，王 旭，尹 松

(1.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201206；2.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 勐侖 666303； 3.內蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心，內蒙古 呼和浩特 010090；4.中海油能源發(fā)展股份有限公司，上海 200941； 5.中國科學院地質與地球物理研究所，北京 100029)

近年來，連續(xù)流技術的元素分析-穩(wěn)定同位素比率質譜儀(EA-IRMS)在線聯(lián)機系統(tǒng)已經(jīng)在食品[1-3]、農(nóng)業(yè)[4-5]、地質[6-9]和環(huán)境[10-11]等領域取得了廣泛的應用?；诳焖偃紵脑?，EA-IRMS將固態(tài)或粘稠態(tài)樣品中總氮、總碳和總硫轉化為氣態(tài)的N2、CO2和SO2，實現(xiàn)了δ15N、δ13C和δ34S的高精度準確測量[12-18]。以往大多數(shù)EA-IRMS是通過70 ℃恒溫氣相色譜柱(GC)分離N2、CO2和SO2樣品，至少需20 min才能完成1次δ15N、δ13C和δ34S分析[17]。較長的分析時間不但增加了測試成本，而且增加了測定結果的不確定性[6,12]。

目前新推出的EA IsoLink元素分析單元在功能設計上新增了程序升溫GC和氦氣節(jié)約模塊[18-19]。程序升溫GC能夠按設定的程序在2 min內升至指定溫度(如240 ℃)，從而對樣品氣進行快速脫附。這不僅可以得到更高靈敏度的峰高信號和尖銳的色譜峰形，還可縮短δ15N、δ13C和δ34S的分析時間(約10 min)[18]。氦氣節(jié)約模塊利用從反應管流出的一部分載氣返回并吹掃進樣口實現(xiàn)節(jié)約氦氣。另外，分析時間的縮短也間接地降低了載氣(氦氣)的使用量。程序升溫GC結合氦氣節(jié)約模塊可以將EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)的氦氣節(jié)省60%以上[19]。由于氦氣資源的緊缺和價格的上漲，該聯(lián)機系統(tǒng)在經(jīng)濟上具有很大優(yōu)勢。

記憶效應主要是指前一個樣品在該聯(lián)機系統(tǒng)管路中的殘留樣品會成為下一個樣品測定的“背景值”[20]，是影響EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)對實際樣品測定精度和準確度的重要因素[6,21]。研究表明[5,9-10,14]，EA-IRMS對δ15N和δ13C的分析通常不存在顯著的記憶效應。由于恒溫GC條件下，SO2脫附較慢且不完全，柱殘留及色譜峰拖尾會導致34S具有一定的記憶效應[6,12]?；诔绦蛏郎谿C的EA-IRMS在每次樣品分析時均對色譜柱進行烘烤，以保持較低的柱殘留[18]。然而，有關其對34S記憶效應影響的研究目前尚未見報道。

鑒于程序升溫GC的EA-IRMS在測定總氮、總碳和總硫穩(wěn)定同位素比率上具有一定的優(yōu)勢和應用前景[18]，本研究擬綜合分析該聯(lián)機系統(tǒng)的穩(wěn)定性和樣品測量的準確性。如，評價具有程序升溫GC的EA-IRMS性能及長期穩(wěn)定性；探討該聯(lián)機系統(tǒng)測定δ34S時硫的記憶效應；揭示不同種類樣品的δ15N、δ13C和δ34S特征。希望為EA-IRMS技術的應用與發(fā)展提供基礎數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與參數(shù)

1.1.1主要儀器 EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)主要由EA IsoLink元素分析單元、ConFlo Ⅳ連續(xù)流接口裝置和DELTA V Advantage穩(wěn)定同位素比率質譜儀3部分組成，均為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

EA IsoLink配有自動進樣器，并安裝了雙反應器：一個是用于氮(N)、碳(C)、硫(S)同位素比率分析的快速燃燒反應器；另一個是用于氫(H)和氧(O)同位素比率分析的高溫轉化反應器?？焖偃紵磻骺砂惭b18 mm外徑的反應管進行常規(guī)進樣量(小于5 mg)樣品的分析；也可安裝25 mm外徑的反應管用于常規(guī)進樣量甚至大于50 mg樣品量(如，元素含量極低樣品)的分析[22]。燃燒反應器采用氧化(三氧化鎢，WO3)和還原(銅，Cu)一體式設計，將被測樣品在高溫和過氧環(huán)境下瞬間燃燒，然后在Cu還原作用下形成N2、CO2和SO2氣體，這些氣體經(jīng)程序升溫GC快速分離后進入ConFlo Ⅳ。

ConFlo Ⅳ是具有自動稀釋功能的連續(xù)流通用接口，采用高純N2(99.999%)、CO2(99.995%)和SO2(99.990%)作為參比氣，并由高純氦氣(99.999%)稀釋和運載，通過內置的開口分流器將參比氣和樣品氣引入DELTA V Advantage同位素比率質譜儀中。

DELTA V Advantage是具有3 kV加速電壓的氣體穩(wěn)定同位素比率質譜儀。在1.6×10-7kPa超高真空條件下，采用通用三杯接收器同時采集N2氣體電離后產(chǎn)生的[14N2]+、[14N15N]+和[15N2]+分子離子束，或CO2氣體電離后產(chǎn)生的[12C16O2]+、[13C16O2]+和[12C16O18O]+分子離子束，或SO2氣體電離后產(chǎn)生的[32S16O2]+和[34S16O2]+分子離子束，再由不同電阻值的放大器轉化為電壓信號，完成δ15N、δ13C和δ34S的檢測。

1.1.2儀器參數(shù) EA IsoLink載氣流速和進樣口吹掃流速分別設定為180、70 mL/min，結合氦氣節(jié)約模塊，從反應管分流的載氣以130 mL/min返回并吹掃進樣口，約2 min后終止該部分氣流的吹掃[19]。氧氣流速設為175 mL/min，噴氧時間設為3 s，對于一次進樣超過1 mg C的樣品，噴氧時間設為6 s。燃燒爐溫度設為1 020 ℃，由于錫囊燃燒放熱，閃燃溫度實際上遠大于1 020 ℃，可確保樣品充分反應[22]。使用程序升溫GC，在δ15N和δ13C測定時GC溫度保持在55 ℃，而后2 min內升溫至240 ℃進行δ34S測定。

進入ConFlo Ⅳ的N2、CO2和SO2樣品氣被氦氣稀釋的比例分別設定為0、79%和0。另外，對于一次進樣超過1 mg C的樣品，CO2樣品氣被氦氣稀釋的比例設為96%。同時測定δ15N、δ13C和δ34S時，在樣品N2或SO2出峰之前引入N2或SO2參比氣，在樣品CO2出峰之后引入CO2參比氣。識別N2、CO2和SO2的起/止色譜峰斜率分別設為0.2/1、0.2/0.4和0.2/1 mV/s。背景值扣除方法采用Calc Mean BGD，即取出峰之前5 s的背景值(BGD)信號的平均值[20]。

1.2 實驗方法

1.2.1EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)性能測試 為了檢驗EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)的氣密性，分別對該聯(lián)機系統(tǒng)m/z28、44、64的背景值(BGD)和空白(空錫囊)信號進行10次測定。如無特別說明，本研究EA-IRMS性能測試和樣品分析均采用18 mm外徑的反應管。

為了評價參比氣的穩(wěn)定性，分別進行了N2、CO2和SO2參比氣的“零”富集測試和線性測試?！傲恪备患瘻y試中，連續(xù)引入10次相等峰高信號的參比氣脈沖，m/z28、44、64的峰高信號均為3 V。線性測試中，連續(xù)引入5～6次不同峰高信號的參比氣脈沖，m/z28、44、64的信號遞增區(qū)間均設為1～9 V。本研究在SO2鋼瓶上安裝了一個40 ℃恒溫減壓閥，并將ConFlo Ⅳ內置的SO2參比氣減壓閥以及IRMS的進氣針閥和離子源切換至加熱狀態(tài)，通過降低SO2氣體的粘滯性優(yōu)化色譜峰形。

在2017年5月至9月這4個月的時間內，連續(xù)建立了δ15N、δ13C和δ34S的標準曲線，以檢驗聯(lián)機系統(tǒng)的長期穩(wěn)定性。構建曲線的標準物質信息列于表1。使用USGS40、USGS41和USGS42共3個δ15N和δ13C標準物質，以(59±12) μg N和(221±32) μg C常規(guī)進樣量，于5月4日、7月27日、8月9日、8月30日和9月4日分別建立了5條δ15N標準曲線和5條δ13C標準曲線。使用IAEA-S-1、IAEA-S-2和IAEA-SO-6共3個δ34S標準物質，以(70±32) μg S常規(guī)進樣量，于5月4日、5月12日和5月19日建立了3條δ34S標準曲線。此外，還建立了小樣品量(9±2) μg N、(33±5) μg C和(8±2) μg S標準曲線，用以比較其與常規(guī)樣品量標準曲線之間的差異性。

表1 測試標準物質的同位素信息Table 1 Isotopic information of the standards

注：結果采用平均值±1SD/‰表示

1.2.234S記憶效應分析 為了探討程序升溫GC的EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)在測定δ34S時硫記憶效應的影響，分別使用18、25 mm反應管測定δ34S相差較大的USGS42、IAEA-SO-6、IAEA-S-1、IAEA-S-2和EMA-P1系列標準物質。每種標物以(50±10) μg S常規(guī)進樣量，至少重復4次。由于25 mm反應管的SO2樣品峰存在一定的延遲和拖尾問題[22]，可能導致其分析δ34S時存在記憶效應，本研究通過采用在不同標物間添加空錫囊測定的方法，檢驗34S記憶效應消除的程度。

1.2.3不同類型樣品同位素比率的測定 將烘干的羊肉(包括腹下肌、肱三頭肌、背最長肌和肱二頭肌)、海參(野生和人工)、金銀花、干酪根、木材和琥珀6種樣品研磨成粉末，根據(jù)N、C、S元素含量分別稱取0.6 mg羊肉、海參和金銀花，1 mg干酪根，1.5 mg木材， 3 mg琥珀，待測樣品用錫囊緊密包裹，每種樣品至少重復測定3次。木材樣品以及構建δ34S標準曲線的IAEA-SO-6屬不易完全燃燒的物質，應與2 mg五氧化二釩(V2O5)一起混入錫囊，由于V2O5的催化作用，即使溫度低于1 000 ℃也能充分燃燒[12,23]。實驗于2017年5月4日采用程序升溫GC的EA-IRMS及其內置熱導檢測器(TCD)，通過一次進樣快速完成樣品中N、C、S同位素組成及元素含量的測定。樣品δ15N和δ13C的測定結果由USGS40、USGS41和USGS42構建的標準曲線進行校正，δ34S由IAEA-S-1、IAEA-S-2和IAEA-SO-6構建的標準曲線進行校正，校正方法參照文獻[24]。

2 結果與討論

2.1 EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)穩(wěn)定性

多次測定表明，EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)m/z28、44、64的背景值(BGD)分別小于45、1、20 mV。BGD低信號表明，該聯(lián)機系統(tǒng)氣密性和運行狀態(tài)良好，受外界環(huán)境干擾小[6,10,15-16]。空白(空錫囊)燃燒產(chǎn)生的[14N2]+、[12C16O2]+和[32S16O2]+信號分別小于10、20、15 mV。本研究絕大多數(shù)樣品信號大于1 V，達到空白信號的50倍以上，因此，可忽略空白對同位素比率測定結果的影響[6]。如果被測樣品信號小于1 V，信噪比降低，空白效應則不可忽略，一般采取差減法[15]進行空白校正。

參比氣的“零”富集測試表明，δ15N、δ13C和δ34S的測定精度分別為0.018‰、0.033‰和0.038‰，均優(yōu)于EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)出廠技術指標0.06‰的要求[20]。線性測試表明，δ15N、δ13C和δ34S與相應的m/z28、44、64峰高信號之間的線性斜率分別為0.001 3‰/V、0.009 6‰/V和0.059 5‰/V，優(yōu)于該系統(tǒng)出廠技術指標±0.066‰/V的要求[20]。

不同時間建立的δ15N、δ13C和δ34S標準曲線均具有較好的重現(xiàn)性，示于圖1。δ15N和δ13C標準曲線(L1～L5)斜率為0.99～1.01，截距分別為(-1.43±0.07)‰和(-32.38±0.12)‰；δ34S標準曲線(L1～L3)斜率為1.05～1.07，截距為(-2.54±0.13)‰。截距表示參比氣的同位素比率[24]均具有良好的重現(xiàn)性。由于SO2目標氣中相等質量數(shù)的32S18O16O對34S16O2存在干擾，即氧同位素影響硫同位素的測定結果[13]，這可能是δ34S標準曲線斜率偏離的重要原因?；趨f(xié)方差(ANCOVA)和最小顯著性差異法(LSD)分析表明，不同時期δ15N、δ13C和δ34S的標準曲線不存在顯著差異(p>0.05)，即無明顯的時間漂移。將USGS42的測定結果(n=41)代入上述任意一條標準曲線中，得到校正后的δ15N和δ13C精度和準確度均優(yōu)于0.3‰，δ34S精度和準確度均優(yōu)于0.6‰，能夠滿足EA-IRMS測試要求[20，22]。這表明，該聯(lián)機系統(tǒng)每隔1個月只需建立1次標準曲線，以提高樣品分析效率。此外，小樣品量標準曲線(δ15N和δ13C，L6；δ34S，L4)與常規(guī)樣品量標準曲線之間存在顯著差異(p<0.01)。因此，小樣品量樣品需要另外建立自身的標準曲線進行校正。

不同時間測定的質控標準δ15N、δ13C和δ34S具有良好的重現(xiàn)性，示于圖2。本研究中，δ15N、δ13C和δ34S的測定結果均采用不同時間建立的標準曲線進行實時校正。5個月內重復測定標準物質USGS42的δ15N、δ13C和δ34S，其平均測定值分別為(8.01±0.11)‰、(-21.11±0.13)‰和(7.77±0.23)‰(n=41)，分析誤差均小于0.1‰。1個月內重復測定IAEA-S-1、IAEA-S-2和IAEA-SO-6三種標準物質的δ34S，其平均測定值分別為(-0.36±0.21)‰(n=14)、(22.56±0.28)‰(n=23)和(-34.14±0.28)‰(n=26)，分析誤差均小于0.1‰。這些測量結果能夠滿足氮、碳和硫元素穩(wěn)定同位素分析精度和準確度的要求[20，22]。

注：*代表小樣品量測定結果建立的標準曲線 圖1 不同測量時間δ15N(a)、δ13C(b)和δ34S(c)的標準曲線Fig.1 Correction curves of δ15N (a), δ13C (b) and δ34S (c) at different measurement times

注：a.USGS42；b.無機硫標物 圖2 不同測量時間標準物質δ15N、δ13C和δ34S的重現(xiàn)性Fig.2 Reproduction of δ15N, δ13C and δ34S of the standards at different measurement times

2.2 燃燒SO2分析法中34S的記憶效應

注：↓代表不同標物間添加1個空錫囊 圖3 18 mm(a)和25 mm(b, c) 反應管分析δ34S時的記憶效應Fig.3 Memory effects for δ34S measured through the 18 mm (a) and 25 mm (b, c) reactor tubes

由于EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)對N2和CO2無顯著柱殘留及峰拖尾[5,9-10,14]，本研究重點探討了34S的記憶效應，示于圖3。結合程序升溫GC，每次樣品分析時均對色譜柱進行烘烤(240 ℃，4 min)，可以保證較低的柱殘留[18]。采用18 mm反應管測定δ34S時無顯著記憶效應(p>0.05)，不同標準物質δ34S的測定精度為0.04‰～0.18‰，示于圖3a。雖然18 mm反應管與25 mm反應管測定同一樣品δ15N、δ13C和δ34S具有較好的重現(xiàn)性(SD<0.15‰，n=6)和一致性(Δ<0.3‰)[22]，但是，采用25 mm反應管測定δ34S時存在一定的記憶效應，δ34S測定精度為0.11‰～0.41‰，示于圖3b。這是由于相同條件下，25 mm反應管的SO2樣品峰比18 mm反應管略有延遲且拖尾[22]。當采用25 mm反應管測試時，在不同標物間添加1個空錫囊后，記憶效應影響顯著減弱，δ34S測定精度達到了0.08‰～0.22‰，示于圖3c。

2.3 不同類型樣品δ15N、δ13C和δ34S的測試結果

以往的EA-IRMS采用恒溫GC分離法，主要用于δ15N和δ13C的分析[4-5,14-16]。但是對于δ15N、δ13C和δ34S同時分析，GC70 ℃恒溫條件會導致SO2出峰較晚和拖尾，存在樣品分析時間較長以及分析效率較低等問題[6,12,17]。本研究采用程序升溫GC的EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)對羊肉、海參、金銀花、干酪根、木材和琥珀樣品中N、C、S元素含量及其同位素組成進行快速測定，結果列于表2。其中，C/N和C/S質量比均小于200的樣品，δ15N、δ13C和δ34S測定精度分別為0.1‰、0.05‰和0.12‰。C/N或C/S質量比大于2 000的木材及琥珀類樣品，其N2和SO2的信號強度小于0.5 V，此時，δ15N和δ34S測定精度分別優(yōu)于0.6‰和0.2‰。這表明，該系統(tǒng)測定不同C/N或C/S樣品時能夠達到研究所需的精度需求[20，22]。進一步分析可知，雖然羊肉不同部位肌肉元素含量差異相差不大(p>0.05)，但其δ15N、δ13C和δ34S差異顯著(p<0.05)，這與文獻[1]的研究結果一致。野生海參與人工養(yǎng)殖海參的δ13C存在顯著差別(p<0.05)，表明二者可能具有不同的食物來源[3]。

表2 不同類型樣品N、C和S同位素組成Table 2 Isotopic composition of different samples

注：元素含量采用平均值(RSD/%)表示，同位素組成采用平均值±1SD/‰表示；每列不同小寫(羊肉：abcd)或大寫字母(海參：AB)代表差異在p<0.05水平上達到顯著

3 結論

本研究采用具有程序升溫GC的連續(xù)流EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)，對δ15N、δ13C和δ34S進行快速(約10 min)測定。結果表明，該聯(lián)機系統(tǒng)的運行狀態(tài)良好，m/z28、44、64的背景值都小于50 mV，空白信號都小于20 mV，參比氣“零”富集測試和線性測試均優(yōu)于儀器出廠技術指標0.06‰和±0.066‰/V的要求。δ15N、δ13C和δ34S標準曲線無顯著時間漂移，每隔1個月只需建立1次標準曲線。6個月內重復測定δ15N、δ13C和δ34S具有良好的長期穩(wěn)定性，外精度和準確度分別優(yōu)于0.3‰和0.1‰。18 mm反應管不存在34S記憶效應，25 mm反應管在添加空錫囊后可將34S記憶效應顯著減弱。針對C/N、C/S均小于200的樣品，δ15N、δ13C和δ34S的測定精度均優(yōu)于0.15‰；對于具有極高C/N或C/S的木材及琥珀類樣品，δ15N和δ34S測定精度分別優(yōu)于0.6‰和0.2‰。