蘇丹紅Ⅱ純物質(zhì)中有機(jī)雜質(zhì)的定性和定量分析

鄧 超，張 偉，黃 挺，張 輝，何雅娟，陶 紅，全 燦，李紅梅

(1.浙江省計(jì)量科學(xué)研究院，浙江 杭州 310018； 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京 100029)

蘇丹紅Ⅱ作為蘇丹紅Ⅰ的衍生物，是一種偶氮化合物類合成色素[1]，主要用于紡織品、橡膠、塑料、油漆等工業(yè)產(chǎn)品的著色[2]。由于其含有芳香族結(jié)構(gòu)，進(jìn)入人體后會(huì)分解還原成芳香胺，芳香胺化合物再次被人體吸收[3]，對(duì)人體健康具有潛在的致癌性[4]。中國(guó)和歐盟均禁止將蘇丹紅色素作為食品添加劑使用[5-6]，但因其成本低[7]、著色性好，仍被很多商家非法使用[8]。因此，食品中蘇丹紅色素的檢測(cè)極為重要[5,9]。

純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是溶液和基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的基礎(chǔ)，是基體中目標(biāo)物準(zhǔn)確測(cè)量的溯源源頭[10]。若純物質(zhì)的純度或其中的雜質(zhì)得不到準(zhǔn)確定值，將會(huì)對(duì)整個(gè)國(guó)家化學(xué)成分測(cè)量的量值傳遞和測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生極其嚴(yán)重的影響，因此，實(shí)現(xiàn)純物質(zhì)中雜質(zhì)的準(zhǔn)確定性和定量一直是分析測(cè)試領(lǐng)域急需攻克的難題[11]。蘇丹紅純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制有利于提高檢測(cè)水平與檢測(cè)準(zhǔn)確度，提高食品質(zhì)量，有利于保護(hù)人民的身體健康，具有廣泛的社會(huì)效益和一定的經(jīng)濟(jì)效益。但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)蘇丹紅Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也無(wú)蘇丹紅Ⅱ中存在的有機(jī)雜質(zhì)的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜-電噴霧-離子阱-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜(HPLC-ESI-IT-TOF MS)法，通過(guò)優(yōu)化液相色譜分離及質(zhì)譜檢測(cè)條件，對(duì)蘇丹紅Ⅱ中主要的有機(jī)雜質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，并利用液相色譜外標(biāo)法準(zhǔn)確定量，希望為蘇丹紅Ⅱ一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間/串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有ESI源)、LC-20AD液相色譜儀：均為日本Shimadzu公司產(chǎn)品；6410QQQ液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、1200型高效液相色譜儀(配有二極管陣列(DAD)檢測(cè)器)：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；XP205型稱量天平(0.01 mg)：瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；Inertsil ODS-SP液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：日本GL Science公司產(chǎn)品。

蘇丹紅Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物原料：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，經(jīng)柱層析方法提純后使用，經(jīng)液相色譜比較確認(rèn)無(wú)新雜質(zhì)引入；蘇丹紅Ⅰ(GB W10056，99.9%)：由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供；溶劑橙2：日本TCI公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲酸(LC/MS級(jí))：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；流動(dòng)相用水為二次去離子水。

1.2 樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

待測(cè)樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用質(zhì)量法配制，以乙腈為溶劑，所有樣品及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液均于4 ℃下密封保存。

1.3 分析方法及實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1有機(jī)雜質(zhì)定性分析 采用HPLC-IT-TOF MS法和HPLC-MS/MS法對(duì)主成分中的有機(jī)雜質(zhì)進(jìn)行定性分析，借助質(zhì)譜儀的高分辨率和精確質(zhì)量數(shù)優(yōu)勢(shì)，由雜質(zhì)化合物各級(jí)質(zhì)譜碎片的測(cè)量值、化學(xué)式和理論值，推測(cè)雜質(zhì)的分子式和結(jié)構(gòu)。

1) HPLC-IT-TOF MS實(shí)驗(yàn)條件

液相色譜條件：Inertsil ODS-SP液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈(25∶75，V/V)；流速0.6 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)范圍190～600 nm；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～600；離子源溫度200 ℃；曲型脫溶劑管(CDL)溫度200 ℃；霧化氣(N2)流速1.5 L/min；碰撞能量為MS150%，MS270%；離子分離時(shí)間50 ms；碰撞氣及冷卻氣為高純氬氣。

2) HPLC-MS/MS實(shí)驗(yàn)條件

液相色譜條件：流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，其他同HPLC-IT-TOF MS色譜條件。

質(zhì)譜條件：ESI離子源；全掃描模式和子離子監(jiān)測(cè)模式，正離子掃描監(jiān)測(cè)；出口電壓135 V，雜質(zhì)1～4和蘇丹紅Ⅱ的碰撞能依次為16、15、10、10、10 eV；干燥氣流速8 L/min；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣壓力3.45×105Pa；碰撞氣為高純氮?dú)狻?/p>

1.3.2雜質(zhì)純品純度定值HPLC條件 雜質(zhì)純品作為對(duì)雜質(zhì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)前需確定準(zhǔn)確純度。溶劑橙2因無(wú)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，故其標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)液相色譜面積歸一化法確定其準(zhǔn)確純度。對(duì)配制的6份溶劑橙2樣品溶液進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，積分得到其有機(jī)純度值。

液相色譜條件：Inertsil ODS-SP 液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相為純水-乙腈(30∶70,V/V)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)范圍190～400 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3有機(jī)雜質(zhì)定量分析 采用液相色譜HPLC外標(biāo)曲線法對(duì)蘇丹紅Ⅱ純品中已確定的有機(jī)雜質(zhì)進(jìn)行定量分析。繪制蘇丹紅Ⅰ雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(0.01～2 mg/L)和溶劑橙2雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(0.19～4.652 mg/L)，配制6份蘇丹紅Ⅱ溶液，分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)，HPLC實(shí)驗(yàn)條件同HPLC-IT-TOF MS中的液相色譜條件。

圖1 蘇丹紅Ⅱ純品中主成分和 雜質(zhì)分離的色譜圖Fig.1 Chromatogram of main component and impurities in Sudan Ⅱ

2 結(jié)果與討論

2.1 蘇丹紅Ⅱ純品中有機(jī)雜質(zhì)的定性

通過(guò)選擇合適的色譜柱對(duì)液相色譜流動(dòng)相的組成、流速等條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了分離蘇丹紅Ⅱ及雜質(zhì)的最佳實(shí)驗(yàn)條件，見1.3.1節(jié)。蘇丹紅Ⅱ主成分及其雜質(zhì)成分的色譜圖和總離子流圖分別示于圖1和圖2。

注：為了防止高濃度的主成分蘇丹紅Ⅱ進(jìn)入 質(zhì)譜儀而造成污染，且已無(wú)其他雜質(zhì)出現(xiàn)， 32.5 min后管路自動(dòng)切至廢液中，不進(jìn)入質(zhì)譜儀掃描 圖2 蘇丹紅Ⅱ純品中雜質(zhì)分離的總離子流圖Fig.2 TIC of impurities in Sudan Ⅱ

分析圖1中色譜歸一化結(jié)果，只有雜質(zhì)2的含量大于千分之一。通過(guò)HPLC-IT-TOF MS獲得的蘇丹紅Ⅱ和4種雜質(zhì)的母離子、子離子的精確分子質(zhì)量列于表1。由于雜質(zhì)含量較低，通過(guò)HPLC-IT-TOF MS獲得的子離子數(shù)目較少，因此，采用HPLC-MS/MS法對(duì)蘇丹紅Ⅱ及其4種雜質(zhì)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜裂解，結(jié)果示于圖3和圖4。通過(guò)質(zhì)譜裂解途徑解析，預(yù)測(cè)未知雜質(zhì)的分子式，并采用相應(yīng)雜質(zhì)的純品進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 蘇丹紅Ⅱ及其雜質(zhì)的母離子和子離子參數(shù)Table 1 Parent ions and product ions of Sudan Ⅱ and the impurities

圖3 蘇丹紅Ⅱ的碎片離子峰及質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Fragment ions and fragmentation pathways of Sudan Ⅱ

圖4 雜質(zhì)1(a)、2(b)、3(c)、4(d)的碎片離子峰Fig.4 Fragment ions of impurities 1 (a), 2 (b), 3 (c), 4 (d)

由圖3和圖4可知，雜質(zhì)1、2和蘇丹紅Ⅱ均有m/z156碎片峰，因此可通過(guò)蘇丹紅Ⅱ的已知結(jié)構(gòu)對(duì)雜質(zhì)1和2的結(jié)構(gòu)式進(jìn)行推導(dǎo)。雜質(zhì)1的分子離子峰[M+H]+為m/z249，比蘇丹紅Ⅱ的分子離子峰[M+H]+m/z277少28(即2個(gè)—CH2)，雜質(zhì)1的可能結(jié)構(gòu)式示于圖5a，可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖6a。雜質(zhì)2的分子離子峰m/z263，與蘇丹紅Ⅱ的分子離子峰m/z277相差14(—CH2)，結(jié)合蘇丹紅Ⅱ的結(jié)構(gòu)式推導(dǎo)出雜質(zhì)2可能的結(jié)構(gòu)式示于圖5b和5c，根據(jù)這兩種結(jié)構(gòu)式查找相關(guān)化合物，發(fā)現(xiàn)b并無(wú)CAS號(hào)，即可暫認(rèn)定雜質(zhì)2的可能結(jié)構(gòu)式為c。推測(cè)其可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖6b。

圖5 雜質(zhì)1(a)和2(b、c)的可能結(jié)構(gòu)式Fig.5 Possible structures of impurities 1 (a) and 2 (b, c)

圖6 雜質(zhì)1(a)和2(b)的質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathways of impurities 1 (a) and 2 (b)

結(jié)合文獻(xiàn)[12]、結(jié)構(gòu)式分析和質(zhì)譜裂解規(guī)律，初步推測(cè)雜質(zhì)1為蘇丹紅Ⅰ，雜質(zhì)2為溶劑橙2。

采用HPLC-IT-TOF MS法對(duì)蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2的純品進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)碎片分析，得到的精確分子質(zhì)量和碎片離子質(zhì)荷比結(jié)果列于表2。

表2 蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2的母離子和子離子參數(shù)Table 2 Parent ions and product ions of Sudan Ⅰand Solvent Orange 2

向蘇丹紅Ⅱ樣品中分別加入蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2進(jìn)行HPLC測(cè)試，結(jié)果示于圖7?？芍?，雜質(zhì)1和2的峰高明顯增加，保留時(shí)間完全一致，從而可以確定雜質(zhì)1和雜質(zhì)2分別為蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2。

通過(guò)比較蘇丹紅Ⅱ樣品中雜質(zhì)及純品的保留時(shí)間、分子質(zhì)量及碎片信息，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)1與雜質(zhì)2分別與蘇丹紅Ⅰ、溶劑橙2完全一致。因此，最終確認(rèn)雜質(zhì)1為蘇丹紅Ⅰ，雜質(zhì)2為溶劑橙2。

雜質(zhì)3和4的準(zhǔn)分子離子峰均為m/z277，且裂解方式符合蘇丹紅Ⅱ的碎裂特征，推測(cè)是蘇丹紅Ⅱ的同分異構(gòu)體，即分子式均為C18H16N2O，可能的結(jié)構(gòu)式示于圖8。由于市場(chǎng)上沒(méi)有該物質(zhì)的純品，所以無(wú)法對(duì)該推測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 雜質(zhì)純品純度定值

雜質(zhì)蘇丹紅Ⅰ采用一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GB W10056，純度標(biāo)準(zhǔn)值為99.9%。

溶劑橙2的液相色譜面積歸一法結(jié)果列于表3，溶劑橙2的純度為99.13%，6次測(cè)量得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.042%。

圖7 添加蘇丹紅Ⅰ前(a)、后(c)和溶劑橙2前(b)、后(d)的蘇丹紅Ⅱ樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of Sudan Ⅱ samples before (a, b) and after (c, d) adding Sudan Ⅰ and Solvent Orange 2

圖8 雜質(zhì)3(a)和4(b)的可能結(jié)構(gòu)式Fig.8 Possible chemical structures of impurities 3 (a) and 4 (b)

樣品 Sample純度 Purity/%199.21299.10399.11499.11599.12699.20平均值99.13相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%0.042

2.3 蘇丹紅Ⅱ純品中主要有機(jī)雜質(zhì)的定量

對(duì)雜質(zhì)1和2定性后，選取相應(yīng)純品，采用外標(biāo)工作曲線法對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。由于雜質(zhì)3和4沒(méi)有相應(yīng)純品，且其是蘇丹紅Ⅱ的同分異構(gòu)體，所以采用與主成分蘇丹紅Ⅱ響應(yīng)因子一致的方法對(duì)這2種雜質(zhì)進(jìn)行定量分析[11, 13]。

蘇丹紅Ⅰ的線性回歸方程為y=81.574x-0.288 6，相關(guān)系數(shù)R2=1。溶劑橙2的線性回歸方程為y=83.417x-0.655 4，相關(guān)系數(shù)R2=1。6份蘇丹紅Ⅱ樣品中雜質(zhì)1～4的測(cè)量結(jié)果列于表4。

表4 蘇丹紅Ⅱ中主要有機(jī)雜質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Contents of main organic impurities in Sudan Ⅱ

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-IT-TOF MS法和LC-MS/MS法對(duì)蘇丹紅Ⅱ中的有機(jī)雜質(zhì)進(jìn)行定性分析，采用HPLC外標(biāo)法對(duì)已定性雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，得到雜質(zhì)蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2的含量分別為0.017%、0.258%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%、2.5%。對(duì)未完全定性的雜質(zhì)3和4采用與主成分蘇丹紅Ⅱ響應(yīng)因子一致的方法進(jìn)行定量分析，其含量分別為0.012%、0.028%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.0%、4.9%。該實(shí)驗(yàn)可為蘇丹紅Ⅱ一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制奠定基礎(chǔ)，對(duì)食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域中蘇丹紅Ⅱ的準(zhǔn)確測(cè)定具有重要意義。