重樓皂苷Ⅰ抑制肺腺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究①

牟海軍 趙 丹 石寒冰 畢紅霞 姜云飛 劉國(guó)華

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸科，齊齊哈爾161000)

肺癌發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤第一位，且早期發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]，而中醫(yī)藥在抗腫瘤方面具有重要的作用。中醫(yī)藥抗腫瘤的基本原則是益氣養(yǎng)陰扶助正氣、清熱解毒祛除邪氣。因此本課題應(yīng)用清熱解毒作用較強(qiáng)的重樓有效成分重樓皂苷Ⅰ，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及相關(guān)因子的影響，明確其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 F12K培養(yǎng)基(Sigma)；胎牛血清(Hyclone)；CCK8試劑(碧云天)；肺腺癌A549細(xì)胞(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院岳麗玲主任惠贈(zèng))； 重樓皂苷Ⅰ(上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司)；Transwell小室(Corning)；Western blot蛋白提取及濃度測(cè)定試劑(碧云天)； MMP-2、E-cad、GAPDH(Proteintech)；二抗(CST)；RNA提取試劑(TIANGEN)；Perfect real time-PCR試劑盒(TAKABA)；PCR引物設(shè)計(jì)及合成(上海生工)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)；BX60F-3熒光照相顯微鏡(Olympus)；5082型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(TECAN)； Bio-Rad Model 785型電轉(zhuǎn)移儀； ChemiDocMP 全自動(dòng)熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(伯樂公司)；7300熒光定量PCR儀(ABI)。

1.2方法

1.2.1應(yīng)用CCK8法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)人肺腺癌 A549 細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌A549細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸后制成單細(xì)胞懸液(密度為0.5×105個(gè)/ml)，按照每孔200 μl接種在96孔板中，接著將96孔板放入CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的重樓皂苷Ⅰ。重樓皂苷Ⅰ的濃度分別為：0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/L。實(shí)驗(yàn)另設(shè)空白對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。加藥48 h后每孔加入CCK溶液10 μl，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各組的增殖抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD 值)×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.2Transwell及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)人肺腺癌 A549 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1.2.2.1Transwell實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌A549細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸后制成單細(xì)胞懸液(密度為0.5×106個(gè)/ml)，按照每孔2.5 ml接種在6孔板中，接著將6孔板放入CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的重樓皂苷Ⅰ。根據(jù)前面重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇重樓皂苷Ⅰ濃度為0.5 mg/L(B組)、1 mg/L(C組)、2 mg/L(D組)、4 mg/L(E組)進(jìn)行藥物干預(yù)，實(shí)驗(yàn)另設(shè)空白對(duì)照組(A組)。于加藥24 h后消化、離心、重懸細(xì)胞，取150 μl接種于Transwell上室中，下室加30%血清培養(yǎng)基500 μl，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后棄掉培養(yǎng)基，用甲醇固定20 min，再用結(jié)晶紫染色20 min，最后用自來流水沖洗，待晾干后應(yīng)用顯微鏡觀察穿過的細(xì)胞數(shù)量。顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)算穿過細(xì)胞數(shù)的平均值并計(jì)算抑制率。抑制率=(1-加藥組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù))×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌A549細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸后制成單細(xì)胞懸液(密度為0.5×106個(gè)/ml)，按照每孔2.5 ml種在6孔板中(板底外側(cè)用記號(hào)筆標(biāo)記3條間隔0.5 cm水平直線)，接著將6孔板放入CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，用10 μl移液器的槍頭尖，沿事先標(biāo)記的水平直線做垂直劃痕，劃完后用PBS沖掉不貼壁的細(xì)胞，然后加入不同濃度的重樓皂苷Ⅰ。重樓皂苷Ⅰ濃度選擇及實(shí)驗(yàn)分組同Transwell實(shí)驗(yàn)。于劃痕后即刻(0 h)、48 h拍照觀察各孔細(xì)胞劃痕狀態(tài)。用Image J圖像軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合距離及抑制率。劃痕愈合距離=0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度；抑制率=(1-加藥組劃痕愈合距離/對(duì)照組劃痕愈合距離)×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.3應(yīng)用Western blot、Qrt-PCR檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞MMP2、E-cad蛋白及mRNA表達(dá)的影響。

1.2.3.1Western blot實(shí)驗(yàn) 前期細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量同Transwell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。于加藥48 h后將細(xì)胞刮下來，收集、離心，然后按照每管加入300 μl細(xì)胞裂解液，冰上放置30 min后，4℃ 15 000 r/min離心5 min后吸取上清即為蛋白樣品，并采用BCA法測(cè)定各樣本蛋白濃度。首先將配好的積層膠加入電泳儀中，再加樣，進(jìn)行電泳，開始0.5 h為70 V，后改為110 V，約1.5 h后上電轉(zhuǎn)機(jī)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，75 V 2 h轉(zhuǎn)膜完畢后用封閉液4℃過夜。第二日從封閉液中取出PVDF膜，然后根據(jù)各蛋白分子量裁剪膜大小，加入配好的抗體，室溫孵育2 h，5%TBST洗膜，放在搖床上5 min洗3次，再加入二抗，1.5 h后加入發(fā)光劑，放在全自動(dòng)熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，應(yīng)用Image Lab軟件分析各條帶灰度，以MMP2、E-cad蛋白與GAPDH內(nèi)參的比值表示MMP2、E-cad的水平。

1.2.3.2Qrt-PCR實(shí)驗(yàn) 前期細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量同Transwell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。于加藥48 h后用RNA提取試劑盒提取總RNA，用Perfect real time-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后行Qrt-PCR。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：MMP2上游5′-GCCCAAGAATAGATGCTGACTG-3′，下游5′-TGAAAGGAGAAGAGCCTGAAGTG-3′；E-cad上游5′-TTCTGGAAGGAATGGAGGAGTC-3′，下游5′-ACCTGGAATTGGGCAAATGTG-3′；GAPDH上游5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游5′-AGCCAATTCGTTGTCATAC-3′。以MMP2、E-cad mRNA和GAPDH的比值表示MMP2、E-cad水平。

2 結(jié)果

2.1重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果見圖1，濃度為0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/L的重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率分別為(2.10±1.2)%、(11.98±2.4)%、(24.32±3.5)%、(38.76±4.3)%、(49.25±4.9)%、(62.55±5.3)%、(83.85±6.4)%，各抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且隨著重樓皂苷Ⅰ劑量的增加抑制率升高，抑制率與劑量呈正相關(guān)，具有量效關(guān)系。重樓皂苷Ⅰ對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的IC50為3.64 mg/L。

2.2重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 從表1和圖2、3可以看出重樓皂苷Ⅰ與空白對(duì)照組比較，劃痕愈合距離縮短，穿過的細(xì)胞數(shù)量減少，具有抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，隨著劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞MMP2、E-cad表達(dá)的影響 從表2和圖4可以看出重樓皂苷Ⅰ與空白對(duì)照組比較，MMP2表達(dá)降低，E-cad表達(dá)升高，隨著劑量的增加，變化幅度增大，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明重樓皂苷Ⅰ可以下調(diào)MMP2表達(dá)，上調(diào)E-cad表達(dá)，并且呈量效依賴關(guān)系。

圖1 重樓皂苷Ⅰ抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖量效曲線Fig.1 Inhibitory effect and concentrations of polyphyllins Ⅰ on proliferation of lung adenocarcinoma A549 line cells

GroupsCell scratchScratch healing distance(μm)Inhibition Ratio(%)Transwell cells testCells countInhibition ratio(%)A240.7±11.7 -250±16 -B177.8±10.31)26.13±2.8186±101)25.32±3.1C158.8±9.41)2)34.01±3.22)166±91)2)33.45±3.42)D141.4±8.51)2)3)41.22±3.92)3)147±101)2)3)43.01±4.22)3)E123.8±8.11)2)3)4)48.54±4.52)3)4)127±91)2)3)4)51.44±4.82)3)4)F 64.95 20.71 59.42 25.01P <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

Note：A.Control group;B.0.5 mg/L polyphyllin Ⅰ;C.1 mg/L polyphyllin Ⅰ;D.2 mg/L polyphyllin Ⅰ;E.4 mg/L polyphyllin Ⅰ.1)Compare with A,P<0.05；2)Compare with B,P<0.05；3)Compare with C,P<0.05；4)Compare with D,P<0.05.

GroupsWestern blotMMP2/GAPDHE-cad/GAPDHQrt-PCRMMP2/GAPDHE-cad/GAPDHA 1.08±0.0620.39±0.0350.95±0.0610.35±0.031B 0.87±0.0581)0.56±0.0471)0.82±0.0591)0.44±0.0491)C 0.65±0.0651)2)0.95±0.0621)2)0.65±0.0641)2)0.64±0.0631)2)D 0.45±0.0461)3)1.15±0.0781)2)3)0.48±0.0621)2)3)0.84±0.0551)2)3)E 0.31±0.0391)2)3)4)1.47±0.0971)2)3)4)0.34±0.0471)2)3)4)0.97±0.0581)2)3)4)F96.17126.0752.7174.53P<0.05<0.05<0.05<0.05

Note：A.Control group;B.0.5 mg/L polyphyllin Ⅰ;C.1 mg/L polyphllin Ⅰ;D.2 mg/L polyphyllin Ⅰ;E.4 mg/L polyphyllin Ⅰ.1)Compare with A,P<0.05；2)Compare with B,P<0.05；3)Compare with C,P<0.05；4)Compare with D,P<0.05.

圖2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響(Transwell實(shí)驗(yàn),×40)Fig.2 Effects of polypyhllin Ⅰ on invasion and metastasis of A549 cells(Transwell test,×40)

圖3 重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響(細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),×40)Fig.3 Effects of polyphyllin Ⅰ on invasion and metastasis of A549 cells(Cell scratch test,×40)

圖4 重樓皂苷Ⅰ對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞MMP2、E-cad蛋白表達(dá)的影響(Western blot)Fig.4 Effects of polypyhllin Ⅰ on MMP2，E-cad protein of A549 cells(Western blot)

3 討論

肺癌分為小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌。腺癌屬于非小細(xì)胞肺癌，是目前肺癌組織分型中最常見的病理類型，約占全部肺癌的40%～50%，肺腺癌大多數(shù)位于肺的外周[2,3]，早期不會(huì)侵犯到氣管及支氣管而引起咳嗽、咳痰、咯血等呼吸道癥狀，容易被忽視，當(dāng)出現(xiàn)癥狀時(shí)，病程多已進(jìn)展為中晚期肺癌。并且肺腺癌早期易侵犯血管及淋巴管，故容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，金晶等[4]研究報(bào)道肺腺癌轉(zhuǎn)移占轉(zhuǎn)移瘤52.0%。因此很多患者失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，預(yù)后較差。治療手段只能以化療為基礎(chǔ)，包括放療、靶向治療、免疫治療、中醫(yī)藥治療等綜合治療。

中藥是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的瑰寶，具有多靶點(diǎn)、多途經(jīng)、作用持久、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，在抗腫瘤方面逐漸被重視，越來越多的中藥被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用[5]，并且很多的西藥，如化療藥物直接來源于天然中藥。中醫(yī)抗腫瘤的方法包括：清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、活血化瘀、扶正固本、益氣養(yǎng)陰、健脾益腎等。重樓，又名七葉一枝花，是一味藥性較強(qiáng)的清熱解毒藥。重樓的化學(xué)成分包括甾體皂苷、游離氨基酸、多糖等，其中甾體皂苷主要為重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ等，約占總化合物的80%[6,7]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)重樓在抗腫瘤方面具有較好的活性。中藥抗腫瘤的機(jī)制包括：①抑制腫瘤細(xì)胞增殖；②影響腫瘤細(xì)胞周期；③誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；④誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬；⑤抑制腫瘤新生血管生成；⑥增強(qiáng)機(jī)體免疫力。重樓皂苷Ⅰ為重樓的主要有效成分，一些研究表明重樓皂苷Ⅰ具有抗腫瘤作用，主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。姜福瓊等[8]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ能夠?qū)螂装┘?xì)胞周期阻滯于G2/M 期;使Bcl-2、Caspase-9減少，Cyt C和Caspase-3增加，影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗膀胱癌作用。羅吉等[9]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ可抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖及通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與其降低Bcl-2 的表達(dá)，升高 Bax 的表達(dá)有關(guān)。陳舒怡等[10]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ能抑制肺癌NCI-H661細(xì)胞增殖，并且能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，呈劑量依賴性，并且能使 Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2表達(dá)減少，分析重樓皂苷Ⅰ可能通過線粒體碎裂誘導(dǎo)NCI-H661凋亡。

關(guān)于重樓皂苷Ⅰ是否具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移及機(jī)制的研究較少，基于此本課題組成員前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察重樓皂苷Ⅰ對(duì)接種肺腺癌 A549 細(xì)胞免疫缺陷 BALB/c裸鼠的抑瘤率、鏡下改變等，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ具有抑制肺癌組織生長(zhǎng)及抗肺癌轉(zhuǎn)移的作用[11]。本課題又采用Transwell及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察重樓皂苷Ⅰ對(duì)人肺腺癌 A549 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ能夠使劃痕愈合距離縮短，穿過Transwell細(xì)胞數(shù)量減少，具有抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，隨著劑量的增加，作用增強(qiáng)，此結(jié)論進(jìn)一步從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了重樓皂苷Ⅰ的抗肺癌轉(zhuǎn)移作用。

目前研究認(rèn)為肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移與MMPs家族及E-cad相關(guān)。MMP2作為MMPs的重要組成在腫瘤組織及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。眾多的研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中的MMP2明顯高于癌旁正常組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)[12-14]。E-cad與腫瘤細(xì)胞的黏附功能有關(guān)。當(dāng)腫瘤組織中的E-cad表達(dá)下調(diào)，其介導(dǎo)的細(xì)胞黏附力減弱后腫瘤組織及細(xì)胞浸潤(rùn)性和游走遷移能力增強(qiáng)，因此腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。熊海林等[15]發(fā)現(xiàn)E-cad 在非小細(xì)胞肺癌、腦轉(zhuǎn)移中存在低表達(dá)。郭曉峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)E-cad在非小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床病理TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示其可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起一定的作用，并能夠預(yù)測(cè)預(yù)后。因此本課題通過Western blot、Qrt-PCR檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞MMP2、E-cad表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP2表達(dá)降低，E-cad表達(dá)升高，隨著劑量的增加，變化幅度增大，表明重樓皂苷Ⅰ可能通過下調(diào)MMP2表達(dá)，上調(diào)E-cad表達(dá)，來達(dá)到抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的能力。本課題組成員還將重樓皂苷Ⅰ與化療藥物聯(lián)合作用于肺腺癌A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者在抑制肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等方面具有增效作用[17]。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移作用，其機(jī)制可能是通過下調(diào)MMP2表達(dá)，上調(diào)E-cad表達(dá)。這是一個(gè)具有廣泛前景的抗腫瘤藥物，值得研究和開發(fā)，但中藥作用途徑廣泛，靶點(diǎn)比較多，本課題主要研究的是重樓皂苷Ⅰ對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞MMP2、E-cad兩個(gè)因子表達(dá)的影響，有沒有其他的途徑及靶點(diǎn)，這將是我們下一步的研究方向。