張 偉 涂敏芳 鄧煥華

(威海市中醫(yī)院，威海264200)

近年來，研究發(fā)現Th17細胞是一類新的CD4+T細胞亞群，它能夠特異性地產生細胞因子IL-17[1，2]；而核孤兒受體-γt(ROR-γt)是它的特異性轉錄因子[3]，ROR-γt可誘導Th17細胞的產生及分化。IL-17具有強大的招募中性粒細胞的作用。因此，Th17細胞介導了中性粒細胞性哮喘氣道炎癥的發(fā)生[4]。本實驗研究擬通過驗證以下假說來說明中性粒細胞性哮喘氣道炎癥的信號轉導通路：轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)與IL-6作為啟動因子，促進幼稚的CD4+T細胞通過JAK-STAT通路向Th17轉化，而ROR-γt是它的特異性轉錄因子，誘導Th17的產生與分化，并分泌炎性因子IL-17，IL-17可招募大量的中性粒細胞，從而引發(fā)中性粒細胞性哮喘。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級SD雄性大鼠24只，體重200～220 g,由蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供(合格證編號：No.201508901)，動物在實驗前適應性馴養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為江西中醫(yī)學院熱敏灸重點實驗室，室溫25℃，空氣濕度50%，通風條件良好。

1.1.2主要試劑和儀器 10%卵白蛋白、脂多糖、TGF-β、IL-6、IL-17酶聯免疫試劑盒(Sigma公司生產)；氫氧化鋁[Al(OH)3]溶液(廣州化學試劑廠)；FITC conjugated anti-CD4、PE-Cy7-conjugated anti-IL-17(eBioscience)；ROR-γt抗體、β-actin 抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；PCR引物(上海生工)；反轉錄試劑盒、Real time PCR mastermix(全式金生物技術有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；超聲霧化器(型號：402AI上海魚躍醫(yī)療設備有限公司)；酶標儀(型號：Multiskan mk3，芬蘭雷勃公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(型號：ChemiDoc MP Bio-Rad公司)；分光光度儀(型號：Nano Drop 2000，Thermo Fisher Scientific公司)；高速冷凍離心機(型號：Micro 21R,Thermo Fisher Scientific公司)；多用途旋轉搖床(型號：QB-206，海門其林貝爾儀器制造有限公司)；Real time PCR儀(型號：ABI7500，Applied biosystems)；SDS-PAGE電泳儀(型號：PowerPac，Bio-Rad公司)；轉膜儀(型號：Trans-Blot Turbo，Bio-Rad公司)；流式細胞儀(CytoFLEX，Beckman Coulter有限公司)；光學顯微鏡(型號：IX73，OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1分組 按隨機數字表法將動物分為正常對照組、模型組、地塞米松組。每組8只。

1.2.2造模方法[5，6]模型組與地塞米松組于實驗第1天和第8天，2次致敏，每只大鼠用1%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg腹腔內注射麻醉后，使其頸部豎直，用移液器取2 mg/kg脂多糖(LPS)經鼻逐滴滴入，利用大鼠呼吸將致敏液吸入氣道，左右鼻孔交替進行并于腹腔內注入卵白蛋白(OVA)0.1 g/kg。從第15天開始，用1%OVA溶液進行霧化吸入激發(fā)，每天霧化30 min，霧化流量3 L/min，連續(xù)霧化2周。正常對照組于實驗第1天和第8天腹腔注射注射用水0.2 ml，于實驗第15天起開始霧化吸入注射用水30 min，霧化流量3 L/min，連續(xù)霧化2周。

1.2.3造模成功標準 以大鼠出現煩躁、嗆咳、打噴嚏、呼吸頻率加快，幅度加大、腹式呼吸明顯和點頭運動，嚴重者呼吸減慢或節(jié)律不整，四肢癱軟，行動遲滯或俯伏不動，反應遲鈍等癥狀為激發(fā)成功。

1.2.4地塞米松干預方法 于實驗開始后第15天起，按0.5 mg/kg予以腹腔注射，每日一次，共14次，每次注射于OVA霧化吸入前0.5 h結束。

1.2.5樣品采集及指標檢測

1.2.5.1HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學 取右肺上葉，石蠟包埋，HE染色，觀察肺泡壁厚度、肺泡大小及融合程度、炎性細胞浸潤情況、黏膜上皮纖維化情況、支氣管平滑肌細胞增生情況等。

1.2.5.2BALF細胞計數及ELISA法測TGF-β、IL-6、IL-17含量。BALF液采集方法：用動脈鉗夾住右肺門，分離頸部氣管，于近氣管開叉處行T型切口，插管至左支氣管下端分叉處，結扎氣管插管處。注射器吸取室溫生理鹽水0.5 ml，左肺變得膨隆、蒼白，回抽灌洗液，反復2次，收至離心管。重復采集3次，4℃下1 500 r/min離心，取上清，-20℃保存，做ELISA?；厥针x心后的細胞沉淀，加0.2 ml紅細胞裂解液，4℃下1 500 r/min離心，棄上清，加1 ml PBS重懸細胞，少量于Neubauer計數臺上做細胞總計數，一般以109L-1表示；剩余懸液注入液基細胞沉降管，經安必平液基細胞沉降式制片、瑞氏染色，計200個細胞做細胞分類計數。

1.2.5.3流式細胞術測外周血及脾臟中Th17的水平 各組大鼠于第28天霧化吸入結束后2 h內取材。3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)行腹腔麻醉，剪開大腿內側肌肉暴露股動脈，先用預先吸有肝素鈉1 ml的注射器經股動脈取血2 ml，作為流式細胞學檢測備用，股動脈放血處死大鼠。打開胸腔與腹腔，取脾臟。

流式細胞術：取新鮮脾及外周血，制備脾(外周血)淋巴細胞懸液，加入1×cell stimulation cocktail刺激淋巴細胞增殖，加入CD4+FITC、IL-17熒光單克隆抗體，運用流式細胞儀檢測IL-17所代表的Th17的含量。采用Flowjo分析軟件。

1.2.5.4免疫組織化學法測定大鼠肺組織中ROR-γt蛋白表達 取右肺中葉，石蠟包埋，脫蠟，水化，封片，一抗孵育，顯色，復染與封片。每個樣本隨機抽取3張免疫組化切片，每張切片在顯微鏡下(×400)隨機選取5個互不重疊視野，測定單位面積陽性細胞表達的平均吸光度值。采用Image-Pro Plus分析軟件進行分析。

1.2.5.5免疫印跡法(Western blot)檢測肺組織中ROR-γt蛋白含量 取右肺下葉組織，肺組織在RIPA蛋白裂解液中裂解，提取蛋白樣品，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，一抗、二抗孵育，化學發(fā)光劑檢測轉印膜上靶蛋白信號。采用Image-Pro Plus分析軟件進行分析。

1.2.5.6逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測肺組織中ROR-γt mRNA的表達 取右肺下葉組織，TRIzol法抽提總RNA,逆轉錄反應，PCR擴增，電泳(見表1)。

2 結果

2.1各組大鼠肺組織病理改變 在光鏡200 μm水平下觀察：正常對照組顯示細支氣管管壁光滑，支氣管平滑肌細胞未見增生，支氣管黏膜皺壁無增生，管腔通暢，管內無炎性滲出物，肺泡壁厚薄均勻一致，肺泡大小均勻一致，肺泡無融合，杯狀細胞無增生，氣道、肺間質、小血管內無明顯炎性細胞；模型組氣管管壁周圍有大量炎性細胞浸潤，主要以中性粒細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞為主；支氣管黏膜皺裳增多延長，杯狀細胞增生明顯，平滑肌增厚，管腔縮窄，內有黏液栓，部分肺泡壁變薄或斷裂，融合成肺氣腫；地塞米松組氣管管壁周圍有少量炎性細胞浸潤；支氣管黏膜皺裳少許增多延長，杯狀細胞少量增生，平滑肌輕度增厚，管腔稍有縮窄，內有少量黏液栓，少量肺泡壁變薄或斷裂，融合成肺氣腫。見圖1。

2.2BALF中白細胞總數，炎性細胞分類計數 各組大鼠BALF溶液回收率>80%，與正常對照組比，模型組中BALF白細胞總數顯著增多(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；其中中性粒細胞百分比、嗜酸粒細胞百分比、淋巴細胞百分比與正常對照組比較均顯著增多(P<0.01)，說明中性粒細胞性哮喘肺內有大量炎性細胞浸潤。地塞米松組與模型組比較，白細胞總數、中性粒細胞百分比、嗜酸粒細胞百分比、淋巴細胞百分比均顯著降低(P<0.01)，說明地塞米松對于控制哮喘炎性反應具有顯著療效(圖2～4)。

表1目的基因的引物序列

Tab.1Primersequencesoftargetgene

PrimernamePrimersequencesAmplifiedfragment lengthROR-γtF:GCAGGAGCAATGGAAGTCG162 bpR:CGCTGAGGAAGTGGGAAAAβ-actinF:TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT220 bpR:CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC

2.3各組BALF液中TGF-β、IL-6、IL-17含量 模型組BALF中TGF-β、IL-6、IL-17的含量與正常對照組比較，顯著升高(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，顯著降低(P<0.01)，說明中性粒細胞性哮喘大鼠支氣管、肺泡中有大量的TGF-β、IL-6、IL-17炎性因子，而地塞米松可顯著控制炎性因子的含量(表2、圖5)。

圖1 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理改變Fig.1 Observe pathological changes of lung tissues in each group though HE stain

圖2 各組大鼠BALF白細胞總計數Fig.2 Total count of WBC in BALF of each group Note:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

圖3 各組大鼠BALF中炎性細胞分類百分比Fig.3 Percentage of inflammatory cell classification in BALF of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

圖4 各組大鼠BALF炎性細胞分類計數(瑞氏染色)Fig.4 Inflammatory cell classification in BALF of each group(Wright′s tain)

表2各組大鼠BALF中TGF-β、IL-6、IL-17的含量比較

Tab.2ContentofTGF-β，IL-6，IL-17inBALFofeachgroup

GroupsTGF-β(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-17(pg/ml)Normal group41.16±10.1346.52±10.7552.54±12.34Model group101.47±23.361)113.73±25.421)167.58±38.941)Dex group77.81±18.541)2)82.56±19.411)2)103.85±23.451)2)

Note：1)P<0.01,vs normal group;2)P<0.01,vs model group.

圖5 各組大鼠BALF中TGF-β、IL-6、IL-17含量的比較Fig.5 Content of TGF-β，IL-6，IL-17 in BALF of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group；##.P<0.01,vs model group.

圖6 各組大鼠脾臟Th17的含量Fig.6 Content of Th17 in spleen of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group；##.P<0.01,vs model group.

圖7 各組大鼠外周血Th17的含量Fig.7 Content of Th17 in peripheral blood of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;▲.P<0.05,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

2.4各組大鼠脾臟及外周血中Th17的含量 以IL-17含量來代表的Th17在脾臟及外周血的含量，模型組Th17所占百分比顯著高于正常對照組(P<0.01)，而地塞米松組顯著高于或高于正常對照組(P<0.01或P<0.05)，而地塞米松組Th17含量與模型組比較則顯著降低(P<0.01)，說明中性粒細胞性哮喘大鼠幼稚的CD4+顯著向Th17分化，而地塞米松可顯著抑制Th0向Th17的分化(圖6、7)。

圖8各組大鼠肺組織ROR-γt蛋白的平均吸光度值

Fig.8AverageopticaldensityofROR-γtproteininlungtissueofeachgroup

Note: ▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

圖9 各組大鼠肺組織中ROR-γt蛋白表達的比較Fig.9 Relative expression level of ROR-γt protein in lung tissue of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

2.5各組大鼠肺組織中ROR-γt蛋白的含量 免疫組化法測得各組大鼠肺組織中ROR-γt平均吸光度值，模型組與地塞米松組皆顯著高于正常對照組(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，ROR-γt蛋白含量顯著降低(P<0.01)，說明ROR-γt參與了中性粒細胞性哮喘的發(fā)作，而地塞米松可以抑制ROR-γt蛋白的水平，從而減輕中性粒細胞性哮喘的程度(圖8)。

圖10 各組大鼠肺組織中ROR-γt mRNA的表達Fig.10 Relative expression level of ROR-γt mRNA in lung tissue of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

2.6肺組織中ROR-γt蛋白的免疫印跡表達 Western blot法測得各組大鼠肺組織中ROR-γt蛋白的免疫印跡表達水平，模型組與地塞米松組ROR-γt蛋白表達皆顯著高于正常對照組(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，ROR-γt蛋白含量顯著降低(P<0.01)，說明ROR-γt參與了中性粒細胞性哮喘的發(fā)作，而地塞米松可以抑制ROR-γt蛋白的水平，從而減輕中性粒細胞性哮喘的程度(圖9)。

2.7肺組織中ROR-γt mRNA的表達 RT-PCR法測得各組大鼠肺組織中ROR-γt mRNA的表達水平，與正常對照組比較，模型組與地塞米松組ROR-γt mRNA表達量均顯著增高(P<0.01)，而與模型組比較，地塞米松組ROR-γt mRNA表達顯著降低(P<0.01)，說明ROR-γt參與了中性粒細胞性哮喘的發(fā)作，而地塞米松可以抑制ROR-γt蛋白的水平，從而減輕中性粒細胞性哮喘的程度(圖10)。

3 討論

Th17目前已證實是由天然T細胞前體Th0分化而來。Th0在特定抗原刺激及多種信號綜合作用下，活化后可以分化為不同的T輔助細胞亞群[7，8]。在轉化生長因子β(TGF-β)和IL-6共同作用下誘導幼稚T細胞向Th17細胞分化，分泌IL-17，并表達ROR-γt[9]，ROR-γt是Th17細胞分化的關鍵轉錄因子。ROR-γt是維甲酸相關核孤兒受體家族成員之一[10]，特異性分布于CD4+CD8+淋巴細胞[11]，受STAT3的調控[12]。ROR-γt可以作為染色體重塑因子開放IL-17基因座位，并使其他因子直接結合到IL-17啟動子上，從而誘導初始CD4+T細胞中IL-17基因的轉錄。在分化成熟的Th17細胞內ROR-γt特異性高表達，而且在初始T細胞內轉入編碼ROR-γt的逆轉錄病毒可誘導初始T細胞分化為Th17，分泌IL-17；當轉錄因子ROR-γt缺陷時，炎癥細胞向組織的募集和浸潤降低，自身免疫性疾病和炎癥性疾病的癥狀緩解[13]。IL-17是Th17的分泌因子[14]。IL-17是一種前炎癥細胞因子，誘導T細胞介導的慢性炎癥反應[15]。IL-17有強大的招募中性粒細胞因子的作用，并抑制Th2型嗜酸性細胞炎性反應。

綜上所述，在ROR-γt特異性高表達下，誘導Th0細胞向Th17轉變，產生大量的IL-17，而IL-17有強大的招募中性粒細胞因子的作用，產生了中性粒細胞參與為主的中性粒細胞型哮喘，而中性粒細胞參與了哮喘的急性發(fā)病及惡化過程。

本實驗研究顯示，中性粒細胞性哮喘的氣道內大量炎性細胞浸潤，主要以中性粒細胞為主，而地塞米松可顯著減少炎性細胞的數量，從而減輕哮喘的發(fā)作。TGF-β、IL-6和IL-17在BALF中大量存在，TGF-β、IL-6有可能為Th17介導的中性粒細胞性哮喘的啟動因子，而IL-17則為下游因子，它可以募集大量的中性粒細胞，引發(fā)急性哮喘的發(fā)作；經地塞米松治療后，TGF-β、IL-6和IL-17在BALF中的含量則顯著降低。經流式細胞技術測定，在脾臟與外周血中可檢測到Th17的存在，且模型組的含量顯著高于正常組與地塞米松組，說明中性粒細胞性哮喘與Th17的升高有高度相關性；在肺組織中，通過免疫組化法及免疫印跡法測得ROR-γt蛋白的表達，RT-PCR法測得ROR-γtmRNA的表達，ROR-γt在中性粒細胞性哮喘模型中均有高表達，而地塞米松可顯著降低ROR-γt的含量，說明ROR-γt參與了Th17細胞的分化過程，并且是促進Th0向Th17分化的關鍵轉錄因子。

因此，中性粒細胞性哮喘與Th17高表達密切相關，而ROR-γt是促進Th0向Th17分化的關鍵轉錄因子，Th17產生大量的IL-17，而IL-17具有強大的募集中性粒細胞的作用，從而使氣道內產生大量的炎性因子，并引發(fā)中性粒細胞性哮喘的發(fā)生。