RNA干擾UBQLN1基因表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機(jī)制研究

胡潺潺 李青山 劉蘭芳 梁云微 朱翠敏 張晶晶 李愛科 王 銳

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，承德067000)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢，對女性的生命健康造成嚴(yán)重的威脅[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移是由多基因、多階段參與的一個復(fù)雜過程，具體作用機(jī)制目前尚未清楚。隨著基因及免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因治療腫瘤有了很大的進(jìn)步，且有大量研究表明在乳腺癌等多種腫瘤中抑癌基因失活、癌基因的激活影響其發(fā)生發(fā)展[2,3]，因此，研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義。泛素1(Ubiquitin 1，UBQLN1)是一個高度保守的泛素樣蛋白質(zhì)，在人體的不同組織均有表達(dá)，與蛋白質(zhì)酶體介導(dǎo)的多種蛋白質(zhì)降解有關(guān)，近些年的研究顯示，UBQLN1可通過參與細(xì)胞凋亡、受體轉(zhuǎn)運、自噬等多種機(jī)制影響腫瘤的侵襲、遷移等過程[4,5]。UBQLN1在乳腺癌中的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中UBQLN1相對高表達(dá)，與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ki67、p53等呈現(xiàn)正相關(guān)，且與患者預(yù)后不良有密切關(guān)系，可能作為預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)[6]。UBQLN1對乳腺癌生物學(xué)特性影響還未清楚。有研究顯示，沉默UBQLN1在乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)可增強(qiáng)輻射敏感性，miR-200c可通過靶向抑制UBQLN1增加乳腺癌的輻射敏感性[7]。因此，本研究中首先檢測了不同乳腺癌細(xì)胞中UBQLN1的表達(dá)，通過RNA干擾抑制其表達(dá)，檢測細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲，并進(jìn)一步研究引起生物特性變化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技公司；CCK8試劑和二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自南京碧云天生物試劑研究所；Transwell小室購自美國Corning公司；UBQLN1、 p53、Survivin、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、STAT3、磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)抗體購自美國Cell signal公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞及其培養(yǎng) 正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌MCF7、MDA-MB-231、T47D、BT549細(xì)胞均購自美國ATCC細(xì)胞庫；細(xì)胞在含血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2Western blot檢測乳腺癌細(xì)胞UBQLN1的蛋白表達(dá) 在生長至對數(shù)期的MCF-10A、MCF7、MDA-MB-231、T47D、BT549細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒對蛋白定量，按照40 μg/孔的蛋白量行SDS-PAGE，蛋白分離后轉(zhuǎn)至NC膜，室溫明膠封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，其中UBQLN1抗體和內(nèi)參GAPDH抗體分別按照1∶500和1∶1 000稀釋，洗膜，室溫孵育二抗(1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)1 h，洗膜，顯色液中顯色。

1.2.3轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細(xì)胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%～90%的生長密度時，用LipofectamineTM2000將干擾UBQLN1表達(dá)的siRNA(UBQLN1-siRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染陰性對照組(NC組)，細(xì)胞中僅加入脂質(zhì)體的為空白對照組，48 h后通過Western blot檢測各組細(xì)胞UBQLN1的蛋白表達(dá)。

1.2.4CCK8法檢測抑制UBQLN1表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響 以1×105ml-1濃度接種生長至對數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞于96孔板，每孔100 μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行同步化處理，參照1.2.3方法將UBQLN1-siRNA和陰性對照組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置5個平行孔，分別于轉(zhuǎn)染的24、48、72 h收集細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加入無血清的培養(yǎng)液，再加入10 μl的CCK8試劑，培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀測定450 nm波長的吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測抑制UBQLN1表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡率檢測使用Annexin V-FITC和PI進(jìn)行熒光染色，通過流式細(xì)胞儀檢測。取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，胰酶消化后將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106ml-1，結(jié)合緩沖液洗滌及重懸細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的Annexin V和PI各5 μl，室溫避光環(huán)境孵育5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.2.6Transwell小室檢測抑制UBQLN1表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響 在Transwell小室的外膜上涂纖維黏連蛋白50 μl，槍頭攤平，風(fēng)干后在內(nèi)膜中鋪Matrigel(按照1∶3稀釋)，37℃條件過夜后將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1.5×106ml-1密度接種于上室中，接種200 μl，Transwell小室的下室中加入600 μl含血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h，棉簽輕輕擦去上室中的細(xì)胞，甲醇固定，洗滌后結(jié)晶紫進(jìn)行30 min的染色，拍照，計數(shù)。

1.2.7p53、Survivin、MMP-2、MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)檢測 提取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后，依次經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉，加稀釋好的 p53、Survivin、MMP-2、MMP-9、STAT3和p-STAT3抗體(稀釋比1∶1 000)，洗膜，孵育二抗，通過顯色液顯色。

2 結(jié)果

2.1UBQLN1在乳腺癌細(xì)胞的表達(dá) UBQLN1在乳腺癌T47D、BT549、MDA-MB-231、MCF7細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果如圖1所示，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與乳腺癌T47D、BT549、MDA-MB-231、MCF7細(xì)胞UBQLN1的蛋白表達(dá)分別為0.088±0.010、0.162±0.018、0.178±0.019、0.389±0.045、0.297±0.034，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與乳腺癌T47D、BT549、MDA-MB-231、MCF7細(xì)胞UBQLN1的蛋白表達(dá)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.898，P=0.000)。與MCF-10A細(xì)胞比較，UBQLN1在四種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。選擇MDA-MB-231細(xì)胞為研究對象。

2.2轉(zhuǎn)染UBQLN1-siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞UBQLN1的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染UBQLN1-siRNA 48 h的細(xì)胞，通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中UBQLN1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，Control 組、NC組和UBQLN1-siRNA組UBQLN1的蛋白表達(dá)分別為0.526±0.058、0.507±0.052、0.153±0.018，三組UBQLN1的蛋白表達(dá)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=62.142，P=0.000)。UBQLN1-siRNA組UBQLN1的表達(dá)顯著低于對照組(P<0.01)，NC組UBQLN1的表達(dá)與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 UBQLN1在乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)Fig.1 Expression of UBQLN1 in breast cancer cellsNote: A.Western blot was used to detect the protein expression of UBQLN1 in breast cancer cells;B.The relative expression of UBQLN1 protein;compared with MCF-10A cells,*.P<0.01.

2.3UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染降低MDA-MB-231細(xì)胞活力 通過CCK8法檢測轉(zhuǎn)染UBQLN1-siRNA后的MDA-MB-231細(xì)胞活力，結(jié)果如表1所示，與NC組比較，UBQLN1-siRNA組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24、48和72 h的細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05)。

2.4UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48 h的細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測促凋亡蛋白p53及抑凋亡蛋白Survivin的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3和表2所示， 與NC組比較，UBQLN1-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，p53蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，Survivin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

圖2 轉(zhuǎn)染UBQLN1-siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞UBQLN1的表達(dá)Fig.2 Expression of UBQLN1 in MDA-MB-231 cells transfected with UBQLN1-siRNANote: A.Western blot was used to detect the protein expression of UBQLN1 in breast cancer cells;B.The relative expression of UBQLN1 protein;compared with Control group,*.P<0.05.

表1UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

Tab.1EffectofUBQLN1-siRNAtransfectiononactivityofMDA-MB-231cells

GroupsOD24 h48 h72 hControl group0.435±0.0380.659±0.0730.902±0.087NC group0.417±0.0340.642±0.0700.894±0.085UBQLN1-siRNA group0.302±0.0271)0.469±0.0531)0.631±0.0721)F14.0757.63010.712P0.0050.0230.011

Note：Compared with NC group,1)P<0.05.

2.5UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室檢測各組細(xì)胞的侵襲能力，Western blot檢測侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4和表3所示，與NC組比較，UBQLN1-siRNA組細(xì)胞的侵襲能力顯著降低(P<0.01)，MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。

圖3 UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of UBQLN1-siRNA transfection on apoptosis of MDA-MB-231 cellsNote: A.Results of flow cytometry;B.Results of Western blot.

表2UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

Tab.2EffectofUBQLN1-siRNAtransfectiononapoptosisofMDA-MB-231cells

GroupsApoptosis rate(%)p53SurvivinControl group2.03±0.240.137±0.0180.377±0.042NC group1.96±0.200.116±0.0140.354±0.038UBQLN1-siRNA group13.78±1.111)0.344±0.0391)0.151±0.0191)F313.35670.02039.008P0.0000.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.01.

圖4 UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響Fig.4 Effect of UBQLN1-siRNA transfection on invasion of MDA-MB-231 cellsNote: A.Transwell were used to detect cell invasiveness;B.Western blot was used to detect the protein expression of MMP-2 and MMP-9.

2.6UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞STAT3信號通路 通過Western blot檢測各組細(xì)胞中STAT3和p-STAT3的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖5和表4所示，與NC組比較，UBQLN1-siRNA組p-STAT3的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，三組間STAT3的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響

Tab.3EffectofUBQLN1-siRNAtransfectiononinvasionofMDA-MB-231cells

GroupsCell invasion numberMMP-2MMP-9Control group 156.3±14.10.374±0.0450.175±0.025NC group 151.9±12.20.351±0.0410.194±0.027UBQLN1-siRNA group 109.8±8.71)0.169±0.0211)0.103±0.0111)F 14.01027.37314.060P 0.0060.0010.005

Note：Compared with NC group,1)P<0.01.

圖5 UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細(xì)胞STAT3信號通路的影響Fig.5 Effect of UBQLN1-siRNA transfection on STAT3 signaling pathway in MDA-MB-231 cells

表4UBQLN1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細(xì)胞STAT3信號通路的影響

Tab.4EffectofUBQLN1-siRNAtransfectiononSTAT3signalingpathwayinMDA-MB-231cells

GroupsProtein relative expressionSTAT3p-STAT3Control group0.425±0.0480.111±0.011NC group0.407±0.0440.120±0.012UBQLN1-siRNA group0.413±0.0450.037±0.0061)F0.12162.023P0.8880.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.01.

3 討論

乳腺癌的治療有手術(shù)、放化療、分子靶向治療和內(nèi)分泌治療，目前分子靶向治療成為研究熱點，有研究顯示，UBQLN1可能是一項用于預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)[6,9]。UBQLN1定位于人類9q22，是泛素樣蛋白家族中的一員，在組織中表達(dá)廣泛，其功能與傳遞蛋白類似，可將多泛素化目標(biāo)提供給特定的蛋白，從而降解蛋白酶體[10]。UBQLN1在腫瘤中的作用研究尚不多，有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中UBQLN1的表達(dá)升高會降低生存期[11]；肺腺癌中UBQLN1的高表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)化[12]；UBQLN1的高表達(dá)增強(qiáng)卵巢癌順鉑耐藥性[13]。UBQLN1在乳腺癌中的作用罕見報道，直到2015年Sun等[7]研究發(fā)現(xiàn)沉默UBQLN1在乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)可增強(qiáng)輻射敏感性，miR-200c可通過靶向抑制UBQLN1增加乳腺癌的輻射敏感性。這提示UBQLN1可能影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究試圖證實UBQLN1對乳腺癌增殖、凋亡、侵襲的影響。

RNA干擾可在轉(zhuǎn)錄水平、染色質(zhì)水平和翻譯水平參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)，有強(qiáng)的序列特異性和有效性，目前已在基因治療腫瘤中廣泛應(yīng)用，且與基因治療腫瘤的其他方法比較效果更優(yōu)[14,15]。為了研究UBQLN1對乳腺癌的影響，通過RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞中UBQLN1的表達(dá)，分別檢測其對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)UBQLN1的表達(dá)受到抑制后乳腺癌細(xì)胞的活力及侵襲能力均明顯降低，且凋亡率增加。這提示UBQLN1可能在乳腺癌中充當(dāng)癌基因樣作用。STATs是有高度同源性的一族轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞的功能，影響靶基因轉(zhuǎn)錄，與腫瘤的凋亡及發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，STAT3是STATs家族中的一個重要成員，目前已證實其在乳腺癌、肺癌、頭鱗癌等多種腫瘤中有過度表達(dá)及激活，異常激活的STAT3可通過影響下游分子p53、Survivin、MMP-2和MMP-9等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此目前將STAT3定義為癌基因[16-18]。p53是一種腫瘤抑制物，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，目前在多種腫瘤中均有研究，乳腺癌中p53的活化可抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡[19,20]。Survivin屬于人類凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的一個成員，在包括乳腺癌在內(nèi)的多種人類腫瘤中高表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡、周期等功能，在乳腺癌等多種腫瘤中抑制Survivin的表達(dá)可增加化療藥物敏感性及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[21-23]。MMP-2和MMP-9為MMPs家族的重要成員，在多種腫瘤中表達(dá)升高，可通過裂解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、脈管生成、轉(zhuǎn)移等[24,25]。乳腺癌中MMP-2和MMP-9的高表達(dá)與其轉(zhuǎn)移進(jìn)展有密切關(guān)系，也有研究發(fā)現(xiàn)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[26,27]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制UBQLN1的表達(dá)可下調(diào)磷酸化的STAT3、Survivin、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，上調(diào)p53的表達(dá)。這提示UBQLN1可通過下調(diào)STAT3信號影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲能力。

綜上所述，抑制乳腺癌細(xì)胞中UBQLN1基因表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞活力和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和下調(diào)STAT3信號通路。其中誘導(dǎo)凋亡的方式是下調(diào)Survivin和上調(diào)p53的表達(dá)，對侵襲的影響是下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)。本研究為UBQLN1在乳腺癌中的作用研究奠定了一定的基礎(chǔ)，由于UBQLN1在乳腺癌中的研究較少，值得進(jìn)一步深入挖掘。