TNF-α通過(guò)調(diào)控KLF4抑制口腔鱗癌細(xì)胞CAL27增殖

龔靖淋 唐朝賢 劉一秀 楊 鑫 張玉蓮

(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫(yī)院，重慶400030)

口腔癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)取得了高速發(fā)展，但患者預(yù)后卻未得到改善[1]。癌細(xì)胞在侵襲之前常常表現(xiàn)為異常基因表達(dá)，并在疾病進(jìn)展過(guò)程中分化為間充質(zhì)細(xì)胞樣狀態(tài)[2]。另外，持續(xù)地細(xì)胞增殖是惡性腫瘤細(xì)胞的另一個(gè)突出特征。細(xì)胞的增殖和分化平衡控制著上皮細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，對(duì)癌癥的病理狀態(tài)起著決定性的作用[3]。這些細(xì)胞過(guò)程通常由腫瘤抑制基因調(diào)控，而在癌癥發(fā)展過(guò)程中抑癌基因常常處于失活狀態(tài)，揭示抑癌基因功能作用對(duì)于了解口腔癌進(jìn)展具有重要意義。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，KLF4是KLF家族中的一個(gè)多功能轉(zhuǎn)錄因子[4,5]，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)、抗病毒免疫等過(guò)程中發(fā)揮著重要功能[6-9]。包括口腔上皮在內(nèi)的復(fù)層鱗狀上皮中，KLF4、KLF5分別在有絲分裂后角化基底細(xì)胞和增殖性低分化基底細(xì)胞中表達(dá)，它們嚴(yán)格控制著上皮細(xì)胞的增殖分化平衡[10]。KLFs可通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)而轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因表達(dá)，先前研究證實(shí)，KLF4表達(dá)缺失與口腔癌細(xì)胞的去分化相關(guān)，并常常在侵襲性口腔癌細(xì)胞中低表達(dá)[10-12]，表明KLF4表達(dá)缺失與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α現(xiàn)作為一種具有多種生物學(xué)活性的多效性細(xì)胞因子能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中CD44、KLF4表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖[13,14]，但在口腔鱗癌中TNF癌能否通過(guò)KLF4調(diào)控細(xì)胞增殖仍然未知。

在本研究中，采用不同濃度 TNF-α(0、1、5、10、20 ng/ml)處理口腔鱗癌CAL27細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)TNF-α對(duì)KLF4表達(dá)的影響；MTT法分別檢測(cè)20 ng/ml TNF-α和過(guò)表達(dá)KLF4對(duì)CAL27增殖的影響；沉默KLF4聯(lián)合TNF-α作用于CAL27細(xì)胞，進(jìn)一步研究KLF4對(duì)TNF-α誘導(dǎo)CAL27增殖抑制的影響，旨在揭示TNF-α治療口腔鱗癌潛能及KLF4表達(dá)在口腔鱗癌中的作用，為更有效治療口腔鱗癌提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1主要材料 DMEM(Dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司，TNF-α購(gòu)自PeproTech公司，KLF4抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology (CST)公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)購(gòu)自碧云天公司，羊抗兔和羊抗鼠二抗購(gòu)自北京全式金公司，RNA提取試劑盒RNAiso plus Reagent、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、qPCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM均購(gòu)自TaKaRa，四甲基偶氮唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)和二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)購(gòu)自Sigma。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞CAL27購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，CAL27在添加有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞加入0、2.5、5、10、20 ng/ml濃度的TNF-α處理24 h用于提取蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用RNAiso plus Reagent提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異引物行PCR擴(kuò)增KLF4 cDNA，并克隆至pcDNA3.1中，構(gòu)建pcDNA3.1-KLF4載體，用pcDNA3.1空載作為空白對(duì)照。KLF4 cDNA擴(kuò)增引物：F：5-CCTCGAGGACCTTCTGGGCCCCCACATTAATG-3 和R：5-CCGCGG-CCGCACTACGTGGGATTTAAAAGTG-3。KLF4 siRNA(5-AUCGUUGAACUCCUCGGUCUCUCUC-3)購(gòu)自上海吉瑪，用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-KLF4和KLF4 siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，進(jìn)行提取蛋白、mRNA及增殖能力檢測(cè)。

1.2.3qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分離提取總RNA，DEPC水溶解后全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)KLF4的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算KLF4相對(duì)表達(dá)量。KLF4引物F：5-ACAAAGAGTTCCCATCTCAA-3和R:5-GTAGTGCCTGGTCATTTC-3；GAPDH引物F:5-GCTCCTCCTGTTCGACAGTCA-3和R：5-ACCTTCCCCATGGTGTCTGA-3。

1.2.4免疫印跡試驗(yàn)(Western blot) 收集處理后細(xì)胞，冷PBS洗滌，后重懸于RIPA裂解液，冰上于搖床搖動(dòng)孵育30 min，裂解完后4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液用BCA法測(cè)蛋白濃度，取30 μg 蛋白配成上樣緩沖液，經(jīng)10%SDS-PAGE膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜和5%脫脂奶粉封閉后，用KLF4、GAPDH一抗及HRP偶聯(lián)的二抗進(jìn)行孵育，ECL曝光液于曝光儀(Bio-Rad)上曝光顯影。用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，測(cè)定KLF4相對(duì)表達(dá)。

1.2.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104ml-1，每孔200 μl接種于96孔板中，分別于24 h、48 h、72 h時(shí)，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，然后棄上清每孔加入150 μl DMSO，于酶標(biāo)儀上振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，測(cè)定490 nm處各孔吸光度值。

2 結(jié)果

2.1TNF-α對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL27增殖的影響 用20 ng/ml的TNF-α處理CAL27細(xì)胞后，MTT檢測(cè)24 h、48 h、72 h其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與TNF-α(0 ng/ml)組相比，在72 h時(shí)TNF-α(20 ng/ml)可顯著抑制CAL27細(xì)胞增殖能力(P<0.05)(圖1)。

2.2TNF-α對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL27中KLF4表達(dá)的影響 口腔鱗癌細(xì)胞CAL27經(jīng)不同濃度的TNF-α(0、2.5、5、10、20 ng/ml)處理24 h后，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α濃度增加，CAL27細(xì)胞中KLF4表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)逐漸增加(P<0.05)(圖2A、B)。

2.3構(gòu)建過(guò)表達(dá)KLF4的CAL27細(xì)胞 為證明TNF-α對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的抑制作用是通過(guò)上調(diào)KLF4表達(dá)介導(dǎo)的，本研究構(gòu)建了過(guò)表達(dá)KLF4的CAL27細(xì)胞株，經(jīng)qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF4后CAL27細(xì)胞中KLF4的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著增加(0.94±0.06、2.03±0.09，t1=17.454，P1=0.000；1.02±0.11、4.05±0.26，t2=18.590，P2=0.000)(圖3)。

2.4過(guò)表達(dá)KLF4對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響 在CAL27細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF4后，利用MTT檢測(cè)過(guò)表達(dá)KLF4對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1相比，在48 h、72 h時(shí)過(guò)表達(dá)KLF4可顯著抑制CAL27細(xì)胞增殖能力(0.51±0.03、0.39±0.02，t48 h=5.765，P48 h=0.005；0.95±0.05、0.56±0.04，t72 h=10.550，P72 h=0.001)(圖4)。

圖1 TNF-α抑制CAL27細(xì)胞增殖Fig.1 TNF-α inhibits proliferation of CAL27 cellsNote: *.P<0.05 compared with TNF-α (0 ng/ml) at 72 h.

圖2 TNF-α誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞中KLF4表達(dá)Fig.2 TNF-α upregulated expression of KLF4 in CAL27 cellsNote: A.Western blot was used to detect the expression of KLF4 in CAL27 cells after treating with different concentration of TNF-α;B.The expression level of KLF4 in CAL27 cells after treating with different concentration of TNF-α,*.P<0.05,compard with 0 ng/ml group.

圖3 構(gòu)建過(guò)表達(dá)KLF4的CAL27細(xì)胞Fig.3 Construction of CAL27 cells overexpressing KLF4Note: A.The expression of KLF4 protein in CAL27 was detected by Western blot;B.The relative expression of KLF4 protein and mRNA in CAL27 after transfecting with plasmids;*.P<0.05 compared with pcDNA3.1 group.

圖4 過(guò)表達(dá)KLF4抑制CAL27細(xì)胞增殖Fig.4 KLF4 inhibits proliferation of CAL27 cellsNote: *.P<0.05 compared to pcDNA3.1 group at 48 h or 72 h.

圖5 沉默KLF4逆轉(zhuǎn)了TNF-α對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖抑制作用Fig.5 Silencing KLF4 reversed the inhibitory effect of TNF-α on proliferation of oral squamous cell carcinomaNote: A.The expression of KLF4 protein in CAL27 was detected by Western blot after transfection of siKLF4;B.The relative expression of KLF4 protein and mRNA in CAL27 after transfecting siKLF4;C.The proliferation of CAL27 cells was detected by MTT;*.P<0.05 compared to Control group,#.P<0.05 compared to TNF-α (20 ng/ml) group.

2.5沉默KLF4逆轉(zhuǎn)了TNF-α對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖抑制作用 為進(jìn)一步證實(shí)，TNF-α是通過(guò)上調(diào)KLF4表達(dá)來(lái)發(fā)揮促進(jìn)CAL27細(xì)胞增殖作用的，本研究用siRNA沉默KLF4，然后再聯(lián)合20 ng/ml的TNF-α處理細(xì)胞，分別用MTT檢測(cè)24 h、48 h、72 h時(shí)各組細(xì)胞吸光值。經(jīng)qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，轉(zhuǎn)染siKLF4后CAL27細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(1.26±0.17、0.53±0.04，t1=7.24，P1=0.014；0.99±0.06、0.32±0.07，t2=12.59，P2=0.000)(圖5A、B)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，沉默KLF4可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)；與TNF-α組相比，沉默KLF4聯(lián)合TNF-α處理可恢復(fù)TNF-α對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.05)。上述結(jié)果表明，TNF-α可能部分通過(guò)上調(diào)KLF4來(lái)發(fā)揮對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的抑制作用。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌(SCC)是我國(guó)常見(jiàn)的致命性惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[15]?？谇击[癌的病因包括使用煙草制品、飲酒以及人乳頭瘤病毒(HPV)感染等[16]。目前，手術(shù)切除聯(lián)合放化療是首選治療策略，但療效仍不理想，其5年生存率較差[16,17]。迄今為止，已經(jīng)尋找到了口腔癌的一些分子標(biāo)記物，但標(biāo)記物明確的預(yù)后或診斷意義尚未確定，因此，尋求新的治療手段及治療靶標(biāo)對(duì)于開(kāi)發(fā)新的有效口腔癌治療策略至關(guān)重要[18]。

在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，癌細(xì)胞主要通過(guò)激活癌基因和/或失活抑癌基因來(lái)促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。據(jù)研究報(bào)道，KLF4可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期在細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[16]；在多種類(lèi)型晚期腫瘤中KLF4表達(dá)降低，且其表達(dá)喪失可導(dǎo)致癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，強(qiáng)烈刺激腫瘤惡性進(jìn)展[18]。最近發(fā)現(xiàn)，在高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞中KLF4表達(dá)上調(diào)，胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的KLF4可通過(guò)降低p27表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。此外，KLF4在口腔癌中同樣具有促癌作用，KLF4可促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲[12,20,21]。據(jù)研究報(bào)道，在低分化和進(jìn)展期口腔癌中KLF4表達(dá)下調(diào)并抑制細(xì)胞分化[10]。此外，李文文等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，KLF4對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖有抑制作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF4后，細(xì)胞增殖能力顯著下降，提示KLF4與口腔鱗癌發(fā)展有關(guān)。

TNF-α作為腫瘤壞死因子在體內(nèi)具有多種生物學(xué)作用，TNF-α在抵抗病原菌感染及抗腫瘤中起著重要作用，是迄今為止抗癌活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，但當(dāng)其超過(guò)一定量時(shí)便會(huì)反過(guò)來(lái)與其他炎性因子一起促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展及引發(fā)多種病理性損傷[21,22]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在口腔癌患者血清中高表達(dá)，且與患者預(yù)后有關(guān)[23]；TNF-α可調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶促口腔癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[24]。此外，TNF-α也可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中CD44、KLF4表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[13,14]，TNF-α是否能夠通過(guò)促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞CAL27中KLF4表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖仍然未知。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，TNF-α可呈劑量依賴(lài)性地促進(jìn)CAL27細(xì)胞中KLF4表達(dá)；20 ng/ml的TNF-α處理CAL27可抑制細(xì)胞增殖，CAL27細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF4后增殖能力顯著降低，而沉默KLF4可部分恢復(fù)TNF-α對(duì)CAL27細(xì)胞增殖抑制作用。綜上所述，TNF-α可誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞CAL27中KLF4表達(dá)增加，KLF4可能參與了TNF-α對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的抑制作用。