喬利峰 董文韜 李 杰 雷春濤 曲 超 林 偉

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院眼科,成都610072)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的惡性腫瘤，是兒童期常見(jiàn)的腫瘤[1]。約三分之二的患者在2歲之前被確診，在5歲之前被診斷約為95%[2]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤會(huì)給患者及其家庭成員帶來(lái)心理影響，造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3,4]。因此，加強(qiáng)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的研究對(duì)人類(lèi)醫(yī)療健康系統(tǒng)及社會(huì)發(fā)展具有重要意義。據(jù)報(bào)道苦參堿、訶黎勒鞣花酸及川芎嗪等一些植物提取物有利于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療[5-7]。五味子作為一種傳統(tǒng)中藥，在神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗氧化和解毒等方面發(fā)揮著積極作用[8,9]。五味子乙素(Schisandrin B,SchB)是五味子果實(shí)的主要活性成分之一，屬于聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素，常被用于炎癥相關(guān)疾病的治療，如肝炎、骨髓炎、婦科疾病及心肌疾病等[10]。另外五味子乙素還具有多種抗癌功能，有利于神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌及膽管癌等癌癥的治療[11-13]。但關(guān)于五味子乙素在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中作用的報(bào)道還十分罕見(jiàn)，有待進(jìn)一步研究。本研究的主要目的是探索五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠存活和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Y79購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)；3周齡，體重20 ～ 24 g的裸鼠來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；五味子乙素(HPLC≥98%)購(gòu)自Solarbio；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleo-tidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (Vascular endothelial growth factor Receptor 2,VEGFR2)抗體、抗P38抗體、抗磷酸化p38 (Thr180/Tyr182) (P-P38)抗體、抗Hsp27抗體和抗磷酸化-HsP27 (Ser82)(P-Hsp27)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Y79細(xì)胞放置于添加了10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,并置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到約80%時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行移植。

1.2.2視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠模型的建立 將0.1 ml的Y79細(xì)胞(5×107個(gè)/ml) 注射于裸鼠皮下，接種后繼續(xù)在無(wú)菌條件下常規(guī)飼養(yǎng)，觀察成瘤情況。當(dāng)腫瘤體積大于50 mm3時(shí)達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，將40只成瘤裸鼠隨機(jī)分為4組：移植瘤模型 (Y79) 組、五味子乙素低中高劑量(10、20、50 mg/kg BW)組，每組10只。五味子乙素處理組于成瘤裸鼠腫瘤內(nèi)注射五味子乙素(10、20、50 mg/kg BW)，連續(xù)7 d。移植瘤模型 (Y79) 組用生理鹽水替代五味子乙素。每5 d測(cè)量腫瘤體積大小，腫瘤體積=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線及存活曲線。

1.2.3TUNEL染色 五味子乙素處理成瘤裸鼠30 d后，取出腫瘤組織。PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊。再用4%的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脫水10 min。脫水機(jī)中脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋及切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于20℃～37℃處理15～30 min。PBS漂洗3次后用3%的H2O2于室溫孵育20 min，隨后PBS清洗3次。然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行生物素標(biāo)記，顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。最后顯微鏡下觀察拍照，細(xì)胞核呈棕色顆粒的為凋亡細(xì)胞。

1.2.4免疫組化染色 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟及水化后用1% 的Triton X-100處理15 min，再用3% 的H2O2處理15 min。5% 的羊血清封閉30 min后依次孵育抗VEGF抗體，4℃,過(guò)夜。第2天孵育對(duì)應(yīng)的二抗，37℃、30 min。最后進(jìn)行染色封片。

1.2.5蛋白印跡 首先腫瘤組織于含蛋白酶抑制劑的裂解液中冰上勻漿，提取總蛋白，100℃變性5 min。等量的蛋白再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的BSA封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜孵育。第2天加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 為分析五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，每5 d測(cè)量腫瘤體積繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。圖1顯示，五味子乙素處理視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠30 d后，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)組腫瘤體積小于移植瘤模型組(P<0.01)。上述結(jié)果表明，五味子乙素可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。

2.2五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠存活率的影響 統(tǒng)計(jì)各組裸鼠的存活率分析五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠存活的影響。由圖2可知，50 mg/kg的五味子乙素處理健康裸鼠未出現(xiàn)死亡。五味子乙素(10、20、50 mg/kg)組裸鼠存活率高于移植瘤模型組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明，五味子乙素可提高視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠存活率。

2.3五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠細(xì)胞凋亡的影響 通過(guò)TUNEL染色分析五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響。如圖3所示，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡高于移植瘤模型組(P<0.01)。由此可見(jiàn)，五味子乙素可促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡。

2.4五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠VEGF表達(dá)的影響 利用免疫組化染色檢測(cè)VEGF表達(dá)，分析五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤組織中VEGF表達(dá)的影響。圖4顯示，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)組裸鼠腫瘤組織中VEGF表達(dá)低于移植瘤模型組(P<0.01)。上述結(jié)果表明，五味子乙素可減弱視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤組織中VEGF表達(dá)。

圖1 五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of schisandra B on growth of tumor in retinoblastoma implantation nude miceNote:SchB.Schisandra B;**.P<0.01，vs Y79.

圖2 五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠存活率的影響Fig.2 Effect of schisandra B on survival rate of retinoblastoma implantation nude miceNote:SchB.Schisandra B;**.P<0.01，vs Y79.

2.5五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠VEGF下游通路活性的影響 為分析五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠VEGF介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響，蛋白印跡檢測(cè)腫瘤組織中VEGFR2、P38、P-P38、Hsp27和P-Hsp27蛋白水平。由圖5可知，五味子乙素(10、20、50 mg/kg)組裸鼠腫瘤組織中VEGFR2蛋白水平及P-P38/P38和P-Hsp27/Hsp27比值低于移植瘤模型組(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明，五味子乙素可降低視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤組織中VEGFR2表達(dá)及P38和Hsp27磷酸化水平，抑制VEGF信號(hào)通路的活化。

圖3 五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠細(xì)胞凋亡的影響(×200)Fig.3 Effect of schisandra B on apoptosis in retinobla-stoma implantation nude mice(×200)Note:The apoptotic cells was stained brown.SchB.Schisandra B;**.P<0.01,vs Y79.

圖4 五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠VEGF表達(dá)的影響(×200)Fig.4 Effect of schisandra B on expression of VEGF in retinoblastoma implantation nude mice(×200)Note:The VEGF positive cells was stained brown.SchB.Schisandra B;**.P<0.01,vs Y79.

圖5 五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠VEGF下游通路蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of schisandra B on expression of downstream of VEGF pathway related proteins in retinoblastoma implantation nude miceNote:SchB.Schisandra B;**.P<0.01 vs Y79.

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年約有8 000例新增視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病例，患者的存活率小于30%[14]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療是相當(dāng)復(fù)雜的，涉及治療策略的選擇，包括摘除術(shù)、放療、化療、激光光凝、熱療和冷凍治療等。目前化學(xué)療法已成為最常見(jiàn)的眼科治療方式。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的化療有四種途徑，包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、眼周內(nèi)和血管內(nèi)的化療，但這些方法存在毒副作用大及院內(nèi)傳播等缺點(diǎn)[15-17]。越來(lái)越多的研究表明植物提取物在各類(lèi)疾病的治療方面發(fā)揮著積極作用[18-20]。

細(xì)胞增殖及凋亡對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展十分重要，大量文獻(xiàn)報(bào)道五味子乙素具有調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)及細(xì)胞凋亡的功效。Xiang等[10]發(fā)現(xiàn)五味子乙素可抑制膽囊癌腫瘤的生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)五味子乙素還可抑制膽管癌移植癌裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。據(jù)報(bào)道五味子乙素處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植癌裸鼠后，腫瘤生長(zhǎng)明顯變慢，細(xì)胞凋亡增加[21]。有數(shù)據(jù)顯示五味子乙素可通過(guò)mTOR通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖及轉(zhuǎn)移[22,23]。本文結(jié)果顯示，五味子乙素可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，提高存活率，促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞凋亡。

VEGF在癌癥中起著重要的調(diào)控作用，越來(lái)越多的研究表明植物提取物具有調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)的作用。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)肉桂提取物可降低卵巢癌腫瘤組織中VEGF表達(dá)。有數(shù)據(jù)顯示五味子多糖提取物可降低腎細(xì)胞癌腫瘤組織VEGF表達(dá)[25]。本文結(jié)果顯示，五味子乙素可減弱視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤組織中VEGF表達(dá)。

VEGFR2介導(dǎo)的P38-Hsp27信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,VEGFR2可促進(jìn)P38和Hsp27磷酸化,激活P38和Hsp27[26,27]。許多植物提取物都可影響VEGFR2信號(hào)通路。Han等[28]發(fā)現(xiàn)銀杏外種皮提取物可降低肺癌小鼠VEGF及VEGFR2表達(dá)。有研究表明一種奎尼酸衍生物可降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞P38的磷酸化水平[29]。有數(shù)據(jù)顯示五味子提取物可降低IL-1β誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞P38的磷酸化水平[30]。本研究結(jié)果顯示，五味子乙素可降低視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠腫瘤組織中VEGFR2表達(dá)及P38和Hsp27磷酸化水平，抑制VEGF信號(hào)通路的活化。

本研究表明，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤移植癌裸鼠中，五味子乙素可抑制腫瘤生長(zhǎng)、提高存活率、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減弱VEGF及VEGFR2表達(dá)，降低P38和Hsp27磷酸化水平。后續(xù)研究將從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及血管新生方面探討五味子乙素對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的影響，為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療提供參考。