彭可君 夏洪嬌 何淑雅 廖永強(qiáng)

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院檢驗科，萍鄉(xiāng)337055)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)以體內(nèi)高滴度的自身抗體為特征的自身免疫慢性炎癥性疾病，尤其以抗核抗體多見。SLE患者體內(nèi)過度的活性氧產(chǎn)物和氧化還原態(tài)的改變可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常激活[1,2],其被認(rèn)為是患者體內(nèi)出現(xiàn)高滴度自身抗體和不同臨床特征的主要原因[3]?；钚匝醭煞帜茇?fù)調(diào)控SLE患者體內(nèi)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過度且使機(jī)體無法及時清除凋亡產(chǎn)物，以致SLE患者體內(nèi)出現(xiàn)大量諸如抗核小體抗體，抗核糖體蛋白抗體和抗dsDNA抗體等[4]。pprI基因為耐輻射奇球菌(D.radiodurans)氧化應(yīng)激中重要的基因，其在大腸桿菌中表達(dá)和在D.radiodurans中一樣可調(diào)節(jié)其他抗氧化基因的表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除保持動態(tài)平衡[5]。pprI基因能在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，且半壽期長，無毒副作用，對動物急性中毒損傷具有救治作用[6]，但是其在SLE小鼠模型中表達(dá)是否能增強(qiáng)SLE小鼠體內(nèi)細(xì)胞的抗氧化作用尚不清楚。本研究擬構(gòu)建pEGFP-c1-pprI真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到SLE小鼠，檢測SLE小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激及疾病活動性指標(biāo)和淋巴細(xì)胞凋亡情況，探討pprI基因表達(dá)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)和疾病活動度的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒 pEGFP-c1-pprI真核表達(dá)載體由南華大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所何淑雅教授贈送。

1.1.2主要試劑與儀器 質(zhì)粒大量抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司，活體基因?qū)雰x(ECM830)購自美國BTX公司，流式細(xì)胞儀(Cytomics FC500)購自美國Beckman公司?？筪sDNA抗體采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，試劑盒購自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸陨虾Ｘ惒┥?，采用考馬斯亮蘭法(Bradford法)測定總蛋白濃度。采用分光光度法測定紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物中還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基濃度(Carbonyls)和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)水平，試劑盒均購自上海貝博生物。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組 62只B6.MRL-FaslprNJU品系系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠，均為雌性，16周，體重(19±2)g。隨機(jī)分為3組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SLE小鼠組(20只)，pEGFP-c1轉(zhuǎn)染SLE小鼠組(20只)，pEGFP-c1-pprI轉(zhuǎn)染SLE小鼠組(22只)，20只純品系C57BL/6健康小鼠為健康對照組。所有小鼠均購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2.2質(zhì)?；铙w電轉(zhuǎn)染小鼠 將質(zhì)粒pEGFP-c1和重組質(zhì)粒pEGFP-c1-pprI以最佳劑量(50 μg/μl)注射入小鼠股前肌，1 min后用ECM830型活體基因?qū)雰x以最佳電場強(qiáng)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3小鼠外周血采取及檢測 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒7 d后，從小鼠眼球取血，置于含肝素鈉的抗凝管中，分成2管，一管分離血漿用于氧化應(yīng)激標(biāo)志物和SLE疾病活動性指標(biāo)的檢測，另一管用于T淋巴細(xì)胞凋亡的檢測。

1.2.4淋巴細(xì)胞凋亡率檢測 取50 μl小鼠靜脈血用PBS洗1次，2 000 r/min，離心5 min棄上清，加400 μl Tris-NH4Cl溶液(pH7.2)混勻，靜置 5 min，破除紅細(xì)胞，然后加PBS至0.5 ml終止。離心收集細(xì)胞(1～5)×105個，加人500 μl的Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V和5 μl PI，避光室溫孵育10 min，送流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5Western blot 取300 μl小鼠全血，加入300 μl 冷的蛋白提取液提取總蛋白 Bradford 法測蛋白的濃度。用含20 μg蛋白溶液經(jīng)12%SDS-PAGE 凝膠電泳轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h，洗膜后加入GFP一抗(稀釋比1∶1 000)，4℃ 過夜，TBST(含0.05%Tween 20 的PBS 緩沖液)洗3次(10 min/次)，加入含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的GFP二抗(稀釋比 1∶2 000)37℃孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑ECL A、B 液等體積加到硝酸纖維素膜上，曝光、顯影1 min，定影1 min。

2 結(jié)果

2.1pEGFP-c1和pEGFP-c1-pprI融合蛋白表達(dá)鑒定 提取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒7 d后的SLE小鼠血漿總蛋白，Western blot鑒定pEGFP-c1-pprI融合蛋白，結(jié)果見圖1，說明pEGFP-c1-pprI能在SLE小鼠中正確表達(dá)，且無毒副作用。

2.2各組小鼠外周血氧化應(yīng)激標(biāo)志物濃度比較 本文對健康和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和pEGFP-c1轉(zhuǎn)染組SLE小鼠相比，pEGFP-cl-pprI轉(zhuǎn)染組GSH含量顯著升高(P<0.05)(圖2A)，MDA、蛋白質(zhì)羰基和GSSG含量顯著降低(P<0.01)(圖2B～D)，SOD、CAT活性顯著升高(P<0.05)(圖2E、F)。與健康對照相比，各項指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見圖2A～F。

圖1 Western blot檢測pEGFP-c1和pEGFP-c1-pprI分別電轉(zhuǎn)染SLE小鼠后融合蛋白表達(dá)情況Fig.1 Fusion protein expression of pEGFP-c1 and pEGFP-c1-pprI in SLE mice identified by Western blot

圖2 各組小鼠外周血氧化應(yīng)激標(biāo)志檢測結(jié)果對比Fig.2 Comparison of oxidative stress markers in periphe-ral blood of mice in each groupNote:*.pEGFP-c1-pprI vs healthy group,P>0.05；#.pEGFP-c1-pprI vs untransfected and pEGFP-c1 transfected group,P<0.01.

2.3各組小鼠外周血疾病活動性指標(biāo)比較 本文對健康和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒小鼠疾病活動性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和pEGFP-c1轉(zhuǎn)染組SLE小鼠相比，pEGFP-c1-pprI轉(zhuǎn)染組血漿補(bǔ)體C4明顯升高(P<0.05)(圖3A)，抗dsDNA抗體滴度、C反應(yīng)蛋白(CRP)顯著降低(P<0.05)(圖3B、C)。與健康小鼠相比，各項指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果見圖3A～C。

2.4健康小鼠和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SLE小鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡檢測 本研究采用Annexin V-FITC/PI雙色法對分離后的淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色，然后利用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞凋亡和壞死情況。早期凋亡淋巴細(xì)胞Annexin V-FITC染色陽性，PI染色陰性，壞死淋巴細(xì)胞和晚期凋亡淋巴細(xì)胞Annexin V-FITC和PI染色同時陽性，結(jié)果見圖4A～D、(橫坐標(biāo)是Annexin-V FITC,縱坐標(biāo)是PI，D2代表死亡的細(xì)胞，D3是存活的細(xì)胞，D4是凋亡的細(xì)胞)。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和pEGFP-c1轉(zhuǎn)染組SLE小鼠凋亡早期淋巴細(xì)胞比率[(20.34±4.75)%和(19.34±2.75)%]明顯高于健康小鼠和pEGFP-c1-pprI組SLE小鼠[(4.55±1.11)%和(3.78±1.52)%],另外，晚期凋亡淋巴細(xì)胞壞死細(xì)胞比率[(2.14±1.01) %和(2.76±0.98)%]明顯高于健康小鼠和pEGFP-c1-pprI組SLE小鼠[(0.74±0.15) %和(1.04±0.16)%],結(jié)果見圖4E、F。

圖3 各組小鼠外周血疾病活動指標(biāo)檢測結(jié)果對比Fig.3 Comparison of disease activity indexes in periph-eral blood of mice of each groupNote:*.pEGFP-c1-pprI vs healthy group,P>0.05；#.pEGFP-c1-pprI vs untransfected and pEGFP-c1 transfected group,P<0.01.

圖4 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙色法檢測SLE患者淋巴細(xì)胞凋亡和壞死情況Fig.4 Detection of apoptosis and necrosis in lymphocytes by flow cytometric using Annexin V-FITC/PI stainingNote:A.Lymphocyte apoptosis and necrosis in healthy mice；B.Apoptosis and necrosis of lymphocyte in group pEGFP-c1-pprI group mice；C.Lymphocyte apoptosis and necrosis in untransfected plasmid mice；D.Lymphocyte apoptosis and necrosis in pEGFP-c1 group；E.Comparison of lymphocyte apoptosis ratio in each group；F.Comparison of lymphocyte necrosis rate in each group.*.pEGFP-c1-pprI vs healthy group,P>0.05；#.pEGFP-c1-pprI vs untransfected and pEGFP-c1 transfected group,P<0.01.

3 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，引起組織損傷。正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除保持動態(tài)平衡，有效的抗氧化防御體系使自由基濃度維持生理性低水平。當(dāng)自由基過度產(chǎn)生或機(jī)體的抗氧化防御體系功能受損時，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[7]。SLE是以體內(nèi)高滴度的自身抗體為特征的自身免疫慢性炎癥性疾病，尤其以抗核抗體見多。SLE發(fā)病機(jī)制的主要問題在于細(xì)胞內(nèi)抗原如何暴露以及免疫系統(tǒng)如何捕獲抗原[8]。SLE患者體內(nèi)過度的活性氧產(chǎn)物和氧化還原態(tài)的改變可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常激活,其被認(rèn)為是患者體內(nèi)出現(xiàn)高滴度自身抗體和不同臨床特征的主要原因[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[10]，SLE患者體內(nèi)氧化還原態(tài)嚴(yán)重失衡導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡和壞死增強(qiáng)，加劇疾病活動度，因此如何平衡SLE患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)減少細(xì)胞凋亡和壞死，減少抗體的產(chǎn)生從而降低疾病活動度是治療SLE患者的關(guān)鍵。pprI基因為D.radiodurans氧化應(yīng)激中重要的基因，pprI基因在大腸桿菌中表達(dá)能誘導(dǎo)過氧化氫酶(KatG)的活性，能使清除自由基的能力顯著提高[11]。叢瑛等[12]研究發(fā)現(xiàn)，pprI基因在酵母菌中表達(dá)能增強(qiáng)其抗氧化能力。肖瀟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，pprI基因在293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且能提高細(xì)胞的抗氧化和抗輻射能力。本文將真核表達(dá)載體pEGFP-c1-pprI電轉(zhuǎn)染入SLE小鼠，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒能夠在SLE小鼠中穩(wěn)定表達(dá)，且無毒副作用，與上述報道一致。通過檢測氧化應(yīng)激標(biāo)志物和疾病活動性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，pEGFP-c1-pprI轉(zhuǎn)染組SLE小鼠GSH含量顯著升高，MDA、蛋白質(zhì)羰基和GSSG含量顯著降低，SOD、CAT活性顯著升高，血漿抗dsDNA抗體滴度和CRP含量顯著降低,補(bǔ)體C4顯著升高，與健康組相比，各項指標(biāo)未見統(tǒng)計學(xué)差異。說明pprI基因在SLE小鼠體內(nèi)表達(dá)能夠提高其抗氧化能力，調(diào)節(jié)SLE小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而降低SLE小鼠疾病的活動度。本文還對SLE小鼠外周血的淋巴細(xì)胞凋亡和壞死情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和pEGFP-c1轉(zhuǎn)染組SLE小鼠相比，pEGFP-c1-pprI轉(zhuǎn)染組SLE小鼠淋巴細(xì)胞凋亡率和死亡率明顯下降，與健康小鼠相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明pprI基因在SLE小鼠體內(nèi)表達(dá)能改變氧化還原狀態(tài)，平衡過度氧化應(yīng)激，改善淋巴細(xì)胞凋亡和壞死情況。

綜上所述，耐輻射奇球菌pprI基因能在SLE小鼠中表達(dá)，且能夠增強(qiáng)SLE小鼠的抗氧化能力，平衡其體內(nèi)過度的氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞凋亡和壞死從而減少體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生，降低SLE小鼠的疾病活動度。本文僅對氧化應(yīng)激和淋巴細(xì)胞凋亡等實驗室指標(biāo)進(jìn)行分析，臨床和病理特征研究有限，因此pprI基因?qū)LE小鼠療效還需更多的實驗研究。