銀杏浸提液對桃金娘葉綠素?zé)晒夂屯寥烂富钚缘挠绊?/h1>
2018-10-12 06:33:18鄭巧巧汪鳳林陳瀟瀟蘭思仁曹光球
西北林學(xué)院學(xué)報 2018年5期
黎 舒，鄭巧巧，汪鳳林，陳瀟瀟，蘭思仁，曹光球
(福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002)
銀杏(Ginkgo biloba)，別名公孫樹、白果，屬裸子植物門銀杏科，雌雄異株，現(xiàn)存 1屬1科1種，素有“活化石”、“植物界的大熊貓”稱號，是我國特有珍稀樹種和優(yōu)勢樹種，1984年被列為國家二級保護植物［1-2］。桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)又稱山稔、稔子、豆稔等，廣泛分布于我國東南部、南部至西南部［3］，在干旱、瘠薄土壤上亦生長良好，是荒山綠化、水土保持的優(yōu)良樹種。
植物化感作用，指的是不同植物(包括微生物)釋放出的化學(xué)物質(zhì)引起的相互作用，體現(xiàn)了植物個體及群體之間相克相生的關(guān)系［4］，1937年德國科學(xué)家H.Molish［5］首次提出化感作用一詞，銀杏葉和外種皮中含有白果酸、氫化白果酸等多種生物活性物質(zhì)［6-7］，劉曉平［8］等研究銀杏酚酸具有致過敏、致突變作用，具有強烈的殺蟲、抗菌、殺菌和抗病毒活性;趙肅清［9］等研究銀杏葉和外種皮物質(zhì)具有一定毒性，銀杏外種皮提取液(2.0 mg·mL－1)使盆栽番茄因青枯病導(dǎo)致的死亡率顯著降低;張美芳［10］等研究銀杏葉提取液可以在一定程度上抑制PPO和POD的活性，有效抑制微生物的生長;秦丹［11］等研究銀杏外種皮和銀杏葉不同溶劑提取液對松材線蟲有抑制作用，以蒸餾水為提取液的外種皮浸提液濃度在20 mg·mL－1時，松材線蟲死亡率達到84.9%;陳虹霞［12］等研究低濃度銀杏葉聚戊烯醇提取物促進小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，增強種子淀粉酶活性。
本試驗與前人研究方法相同，不同的是研究對象為桃金娘，目前關(guān)于銀杏套種桃金娘方面的研究在國內(nèi)鮮見報道。本試驗從化感作用的角度揭示桃金娘是否適合在林下種植，以及2種植物種間是否有良好的生化關(guān)系，探討銀杏葉和根系分解釋放的物質(zhì)在進入土壤物質(zhì)循環(huán)后，對受體植物桃金娘生長所產(chǎn)生的綜合影響如何。本研究采用盆栽試驗，以桃金娘為受體，模擬自然界中銀杏葉和根在土壤內(nèi)分解過程中對其生長的影響，以期為銀杏葉、根對桃金娘化感作用的深入研究提供參考依據(jù)，將對銀杏農(nóng)林復(fù)合模式中搭配樹種的科學(xué)選擇具有重要的借鑒和參考。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗材料為銀杏葉和根，取自福建省龍巖市長汀縣策武鎮(zhèn)南坑村21年生銀杏園，收集銀杏葉，取表層土20 cm以下根系，所取樣品采用裝有冰袋的－4℃便攜式保溫箱低溫保存帶回實驗室。取完后將土覆蓋回原處，避免影響銀杏的正常生長;試驗受體植物材料為3年生桃金娘，購自沭陽縣新泰綠化苗木公司(采用種子播種，大棚規(guī)?；N植)。參試桃金娘植株選擇生長情況基本一致的健康苗木，平均苗高60～63 cm，平均地徑0.9～1.3 cm。選擇栽培基質(zhì)(草炭土 ∶黃壤 ∶細沙為2∶6∶2)將其充分混勻，平鋪晾至2 d待用，盆栽試驗的栽植容器為上口徑27 cm、高20 cm的塑料盆缽，每盆裝土7 kg，每盆栽種2株桃金娘。
1.2 方法
1.2.1 銀杏葉和根浸提液的制備 采用單因素試驗法，將收集的銀杏葉和根用清水洗凈泥土、晾干、剪碎，隨機取100 g放置于燒杯中，加入1 L蒸餾水搖勻用保鮮膜封住瓶口，放置48 h后，用紗布將葉和根系過濾取上清液，配制成0.10 g·mL－1提取液，將提取液放置于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 盆栽試驗的布設(shè) 以蒸餾水為對照(CK)，將所制得的銀杏葉浸提液提取稀釋成 0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 g·mL－1不同梯度試驗品，標記為試驗1～5，銀杏根浸提液提取稀釋成0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 g·mL－1不同梯度試驗品，標記為試驗6～10，以蒸餾水為對照(CK)，標記為試驗11(表1)。每個濃度梯度試驗設(shè)置3盆重復(fù)，11組試驗共33盆。2017年3月10日在福建農(nóng)林大學(xué)科研園區(qū)種植試驗苗，溫室培養(yǎng)溫度(20±5)℃，光照強度 300 μmol·m－2·s－1，晝夜光照時間:12 h/12 h。將浸提液從冰箱取出，放置常溫后，用銀杏葉和根的不同梯度浸提液分別澆灌桃金娘苗木，一次性澆透，之后每3 d澆1次，每盆500 mL，保證土壤含水量在20%～30%。培育期間進行正常的管理培養(yǎng)。
1.2.3 指標測定
1.2.3.1 桃金娘生長量測定時間 處理前(3月10日)測定桃金娘苗高和地徑，處理3個月后(2017年6月10日)，測定其苗高和地徑。
1.2.3.2 桃金娘生長量測定 采用游標卡尺測量桃金娘苗高和地徑(苗高測量精度±3.50 cm;地徑測量精度±0.20 cm)。
1.2.3.3 葉綠素?zé)晒鉁y定 采用 Handy Fluor Cam熒光成像儀(Photon Systems Instruments公司生產(chǎn))測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，選取主莖上完全展開的桃金娘葉子進行測定，每個處理組重復(fù)測定3次。在測定前先對葉片進行20 min暗反應(yīng)處理，測定指標為最小熒光變量(minimal fluorescence，F(xiàn)o)、最大熒光變量(maximum fluorescence，F(xiàn)m)、可變熒光(variable fluorescence，F(xiàn)v)、最大光能轉(zhuǎn)換效率(maximal photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm)、PSⅡ潛在活性(potential photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fo)［13］。
1.2.3.4 酶活性含量測定 盆栽土壤酶活性測定方法［14-17］采用新鮮土樣測定，土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸法，土壤脲酶活性采用次氯酸鈉比色法，蛋白酶活性采用茚三酮比色法，纖維素酶的活性測定采用蒽酮比色法，過氧化物酶活性采用沒食子酸比色法，多酚氧化酶活性采用沒食子酸比色法，酸性磷酸酶活性測定采用苯酚鈉比色法。
1.3 數(shù)據(jù)處理
用Microsoft Excel 2003進行原始數(shù)據(jù)處理，利用SPSS Statistics 18.0進行單因素方差分析(Oneway ANOVA)和LSD多重比較分析以及Pearson相關(guān)性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 浸提液對桃金娘生長的影響
銀杏葉和根浸提液對桃金娘生長的影響見表1。由表1可知，由于桃金娘苗木購自苗木公司，植株生長情況不能保持完全一致，對苗木的生長量測定試驗產(chǎn)生了一定影響。3月初種桃金娘時，試驗4、5、10的試驗苗的苗高有一定差距，11組試驗苗的地徑差異性顯著。6月測定桃金娘苗木生長3個月后的狀況，11組試驗苗的苗高差異性不顯著，地徑差異性顯著。由試驗苗增長量可知，桃金娘苗木的苗高增長量差異性顯著，試驗4的增長量最大，試驗9、10的增長量最小;地徑增長量差異性顯著，試驗2的增長量最大，試驗9、10的增長量最小，低濃度的銀杏根浸提液(試驗9、10)對苗木的苗高、地徑的增長作用不明顯，11組試驗苗未出現(xiàn)生長停滯和枯死現(xiàn)象，說明了銀杏葉和根浸提液對桃金娘苗木的生長抑制作用不顯著。由于試驗時間(3個月)過短和試驗苗木本身存在顯著性差異，對本試驗的測量結(jié)果影響很大，不能明確判斷出浸提液對桃金娘苗高、地徑的生長影響是否顯著;不同濃度同一器官的浸提液處理對桃金娘生長的影響顯著性判斷依據(jù)不足，因此，對本試驗中銀杏浸提液對桃金娘生長的影響進行下一步探究。
2.2 銀杏葉和根浸提液對桃金娘葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
圖1顯示了銀杏葉和銀杏根不同濃度浸提液對桃金娘葉最小熒光變量Fo、最大熒光變量Fm、可變熒光Fv、最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/Fo這 5 個指標的影響。處理 1、2、6、7、8 的最小熒光變量Fo均＜處理11，其中:處理1比處理11減少 4.72%、處理 8 比處理 11 減少 4.04%;處理 3、4、5、9、10的最小熒光變量Fo均高于處理11，其中:處理5比處理11增加20.27%、處理10比處理11增加13.12%。銀杏葉和根不同濃度浸提液對Fo影響較大，處理5和處理4、10差異性不顯著，和其余8組處理結(jié)果差異達顯著水平。最大熒光變量Fm的變化和最小熒光變量 Fo相似，處理 1、2、3、6、7、8 的最大熒光變量Fm均＜處理11，其中:處理2比處理11減少4.81%、處理 8 比處理 11 減少6.17%;處理 4、5、9、10的最大熒光變量Fm均高于處理11，其中:處理 4 比處理 11 增加 3.47%、處理10比處理11增加3.79%，表明不同濃度浸提液對Fm影響較小。處理 1、2、3、5、6、7、8 的可變熒光(Fv)均低于處理11，其中:處理2比處理11減少4.80%、處理 7 比處理 11 減少6.31%;處理 4、9、10的可變熒光(Fv)均高于處理11，其中:處理4比處理11增加3.47%、處理10比處理11增加3.79%。以上最小熒光變量Fo、最大熒光變量Fm和可變熒光Fv3個指標均呈現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，最大光能轉(zhuǎn)換效率和PSⅡ潛在活性，在非脅迫條件下，該參數(shù)的變化極小，不受生長條件的影響，只有在脅迫條件下該參數(shù)明顯下降。銀杏葉和根在相同濃度的提取液澆灌影響下，桃金娘葉綠素?zé)晒饨Y(jié)果呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，從各試驗的最大影響結(jié)果來看:最小熒光變量(Fo)試驗中，處理5(20.27%)＞處理10(13.12%);最大熒光變量(Fm)試驗中，處理 2(4.81%)＜處理 8(6.17%);可變熒光(Fv)試驗中，處理 2(4.80%)＜處理 7(6.31%);最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)試驗中，處理 5(3.09%)＞處理 10(1.18%);PSⅡ潛在活性 Fv/Fo試驗中，處理 5(21.59%)＞處理 10(8.99%)，銀杏葉浸提液在最小熒光變量Fo、最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/Fo3組試驗中影響比銀杏根浸提液顯著，銀杏根浸提液在最大熒光變量Fm、可變熒光Fv2組試驗中影響比銀杏葉浸提液顯著，即銀杏葉和根浸提液對桃金娘葉綠素?zé)晒饩胁煌潭鹊挠绊?。由?可知，最大熒光變量Fm和可變熒光Fv試驗差異性不顯著，最小熒光變量Fo、最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/Fo試驗差異性顯著。
表 1 桃金娘生長狀況［1，2］Table 1 Growth status of Rhodomyrtus tomentosa
圖1 葉綠素?zé)晒鈭D譜Fig.1 Chlorophyll fluorescence spectrum
2.3 銀杏葉和根浸提液對酶活性的作用
圖2和表3顯示了銀杏不同濃度浸提液對桃金娘土壤纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶這7個酶活性指標的影響。
纖維素酶活性試驗，處理 3即 0.025 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的桃金娘土壤中纖維素酶活性值最大，處理2即0.05 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的土壤中纖維素酶活性值最小，其中:處理2和處理11(CK)差異不顯著(P＞0.05)，處理3比處理11增加59.34%，除處理 2比處理 11減少 1.56%，其余 8組處理纖維素酶活性均比處理11增加，同時和處理11差異顯著(P＜0.05)，除處理3外，同一濃度處理的銀杏葉和根浸提液(處理1和處理6、處理2和處理7、處理4和處理9、處理5和處理10)對纖維素酶活性影響差異不顯著(P＞0.05)。
蔗糖酶活性試驗，處理 6即0.1 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的桃金娘土壤中蔗糖酶活性值最大，處理10即0.006 25 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中蔗糖酶活性值最小，其中:處理10比處理11減少36.64%，處理1～9比處理 11增加 52.31%～279%，處理6、7、8和處理11的蔗糖酶活性結(jié)果差異性顯著，即銀杏根提取液處理酶活性差異性極顯著(P＜0.01)，說明銀杏葉浸提液對蔗糖酶活性影響較大。
表2 葉綠素?zé)晒怙@著性分析［3］Table 2 Significance analysis of chlorophyll fluorescence
圖2 酶活圖譜Fig.2 Enzyme activity
脲酶活性試驗，處理 10 即 0.006 25 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的桃金娘土壤中脲酶活性值最大，處理9即0.012 5 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中脲酶活性值最小，總體呈現(xiàn)“U”字形曲線，其中:處理10比處理11增加了12.09%，其余9組處理脲酶活性均比處理11減少，處理9比處理11減少了80.47%，銀杏葉和根浸提液對脲酶活性均有一定影響，脲酶活性差異性極顯著(P＜0.01)，同一濃度浸提液處理銀杏根浸提液對脲酶活性影響更大。
酸性磷酸酶活性試驗，處理3即0.025 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的桃金娘土壤中酸性磷酸酶活性值最大，處理 7 和 9 即 0.05 g·mL－1和0.0125 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中酸性磷酸酶活性值最小，總體呈現(xiàn)出“W”形趨勢，其中:處理1比處理11增加了0.85%，處理3比處理11增加了2.74%，其余處理均比處理11減少，同一濃度處理，銀杏根浸提液對酸性磷酸酶活性抑制作用較大。
多酚氧化酶活性變化，總體呈現(xiàn)“低促高抑”趨勢，處理8即0.025 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的桃金娘土壤中多酚氧化酶活性值最大，處理1即0.1 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的土壤中多酚氧化酶活性值最小，其中:高濃度提取液抑制多酚氧化酶活性，處理1～4 和處理 6、7、9 比處理 11 減少了0.47%～60.76%，低濃度提取液促進多酚氧化酶活性，處理5、8、10比處理11增加了0.46%～10.28%，多酚氧化物酶活性差異性極顯著(P＜0.01)。
過氧化物酶活性試驗，處理11即對照組(CK)澆灌的桃金娘土壤中過氧化物酶活性值最大，處理3即0.025 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的土壤中過氧化物酶活性值最小，其中:10組處理均比處理11減少，處理 6、7、8 比處理 11 減少 56.71%～66.16%，處理3比處理11減少79.36%，高濃度銀杏根提取液澆灌下過氧化物酶活性處理值同處理11呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，即在同一濃度處理，銀杏根浸提液對過氧化物酶活性抑制作用較大。
表3 酶活顯著性分析Table 3 Significance analysis of enzyme activity
蛋白酶活性試驗，處理1即 0.1 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的桃金娘土壤中蛋白酶活性值最大，處理9即0.012 5 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中蛋白酶活性值最小，其中銀杏葉浸提液對蛋白酶活性影響較大，處理1比處理11增加138.32%，處理2比處理11增加 118.47%，處理 6比處理 11增加111.64%，處理 9 比處理 11 減少 36.15%，差異性極顯著(P＜0.01)。
在低濃度浸提液處理下，即試驗 4、5、9、10，纖維素酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶對照之間差異不顯著，中、高濃度浸提液處理下試驗1～3、6～8對這7種酶的活性均有不同程度的影響，高濃度的銀杏葉浸提液，試驗1將纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶活性增強了 9.44%、52.71%、－45.13%、0.87% 、－37.80%、－17.28%、138.32%;高濃度的銀杏根浸提液，試驗6將纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶活性增強了11.70%、279.04%、－50.98%、－ 1.84%、－ 2.85%、－ 60.80%、111.64%，銀杏根浸提液對酶活性響應(yīng)較大。
3 結(jié)論與討論
銀杏葉和根浸提液對葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)不顯著，葉浸提液對酶活性響應(yīng)不顯著，根浸提液對酶活性響應(yīng)較大。不同濃度浸提液澆灌下，桃金娘呈生長態(tài)勢，因此，銀杏和桃金娘二者為互利效應(yīng)，銀杏農(nóng)林復(fù)合模式中可以搭配桃金娘，將對銀杏林林下復(fù)合模式生態(tài)環(huán)境修復(fù)和發(fā)展林下經(jīng)濟具有重要的借鑒和參考。
銀杏葉和根浸提液對桃金娘植株生長均起到了促進作用，同一濃度不同器官的浸提液處理，根浸提液對桃金娘苗高、地徑的生長影響不顯著;不同濃度同一器官的浸提液處理對桃金娘生長的影響不顯著。陳虹霞［12］等研究低濃度銀杏葉聚戊烯醇提取物能夠促進小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，高濃度提取物對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長呈現(xiàn)抑制作用;劉冬杰［18］等研究隨著刺槐枯落葉浸提液濃度的增大，對種子發(fā)芽、幼苗生長的抑制作用強度增大;范淑英［19］等研究低濃度浸提液對幼苗生長起促進作用。本研究結(jié)果不一致的原因可能是試驗時間過短，桃金娘植株生長量小，促進抑制作用不顯著。因此，需要進行更長一段時間的研究。
作物產(chǎn)量和植物生物量形成的生理基礎(chǔ)是光合作用，其中葉綠素?zé)晒鈪?shù)常用來判斷植物光合作用受到逆境脅迫的傷害，如今植物體內(nèi)的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)研究已成為熱點，在植物逆境生理研究中得到廣泛的應(yīng)用［20］。葉綠素?zé)晒庑盘柊素S富的光合作用過程變化的信息，在林木栽培、林木逆境生理等方面的應(yīng)用較廣［21-22］。本試驗最小熒光變量Fo、最大熒光變量Fm、可變熒光Fv這3個指標呈現(xiàn)出“低促高抑”趨勢，最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm是0.83～0.86，試驗組和 CK 試驗相比是降低的趨勢，與陳辰［23］等植物葉綠素?zé)晒?Fv/Fm一般在0.75～0.85，植物在脅迫生長條件下，葉綠素?zé)晒釬v/Fm降低，PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)化過程不成為其限制因子的結(jié)果相同;與李曼［24］等在 3.0 mg·L－1BPA 可降低大豆和玉米初始熒光Fo，PSⅡ中心受損，光能轉(zhuǎn)化和電子傳遞效率降低的結(jié)果，以及王春晴［25］等研究木麻黃浸提液處理下青皮苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)中Fo、Fv/Fm、Fv/Fo等存在顯著差異的結(jié)果相同。植物在脅迫生長條件下，即高濃度浸提液試驗，桃金娘葉綠素?zé)晒鈪?shù)降低，說明銀杏浸提液對桃金娘植株生長有一定影響。
土壤酶活性與植物生長、植物抗逆性生理密切相關(guān)，是土壤生物性能的一種最穩(wěn)定和最敏感的指標，是測定土壤污染所導(dǎo)致的各種變化的一種生物學(xué)方法［26-27］。本試驗結(jié)果中纖維素酶活性略有增強，蔗糖酶和蛋白酶活性同周玉祥［28］等研究酶活性的趨勢變化結(jié)果相同，蔗糖酶能為土壤生物體提供充分能源，增加易溶性營養(yǎng)物質(zhì)，反映了土壤有機碳累積與分解轉(zhuǎn)化的規(guī)律，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越強;蛋白酶活性通常被認為是依賴于土壤微生物生物量水平，土壤蛋白酶活性提高，與本研究中加入的銀杏浸提液提高了土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量有關(guān)，具體需進行微生物試驗研究。脲酶和酸性磷酸酶與土壤氮、磷循環(huán)相關(guān)，脲酶活性在浸提液的影響下顯著減少，高濃度浸提液對活性破壞較大，同賈麗琴［29］等的研究結(jié)果脲酶活性顯著提高不同，低濃度浸提液能夠提高脲酶活性，高濃度則是抑制作用，有待于進一步試驗證明;酸性磷酸酶活性呈現(xiàn)“W”形曲線，低濃度浸提液處理和CK處理差異性不顯著;多酚氧化酶活性呈現(xiàn)“低促高抑”趨勢;過氧化物酶活性呈現(xiàn)減少趨勢，根浸提液試驗對酶活性的影響較大，同倪學(xué)文［30］等研究銀杏外種皮酚酸含量更高的結(jié)果相近，銀杏種皮含有的化感物質(zhì)是否更高，有待下一步的研究證明。
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銀杏(Ginkgo biloba)，別名公孫樹、白果，屬裸子植物門銀杏科，雌雄異株，現(xiàn)存 1屬1科1種，素有“活化石”、“植物界的大熊貓”稱號，是我國特有珍稀樹種和優(yōu)勢樹種，1984年被列為國家二級保護植物［1-2］。桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)又稱山稔、稔子、豆稔等，廣泛分布于我國東南部、南部至西南部［3］，在干旱、瘠薄土壤上亦生長良好，是荒山綠化、水土保持的優(yōu)良樹種。
植物化感作用，指的是不同植物(包括微生物)釋放出的化學(xué)物質(zhì)引起的相互作用，體現(xiàn)了植物個體及群體之間相克相生的關(guān)系［4］，1937年德國科學(xué)家H.Molish［5］首次提出化感作用一詞，銀杏葉和外種皮中含有白果酸、氫化白果酸等多種生物活性物質(zhì)［6-7］，劉曉平［8］等研究銀杏酚酸具有致過敏、致突變作用，具有強烈的殺蟲、抗菌、殺菌和抗病毒活性;趙肅清［9］等研究銀杏葉和外種皮物質(zhì)具有一定毒性，銀杏外種皮提取液(2.0 mg·mL－1)使盆栽番茄因青枯病導(dǎo)致的死亡率顯著降低;張美芳［10］等研究銀杏葉提取液可以在一定程度上抑制PPO和POD的活性，有效抑制微生物的生長;秦丹［11］等研究銀杏外種皮和銀杏葉不同溶劑提取液對松材線蟲有抑制作用，以蒸餾水為提取液的外種皮浸提液濃度在20 mg·mL－1時，松材線蟲死亡率達到84.9%;陳虹霞［12］等研究低濃度銀杏葉聚戊烯醇提取物促進小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，增強種子淀粉酶活性。
本試驗與前人研究方法相同，不同的是研究對象為桃金娘，目前關(guān)于銀杏套種桃金娘方面的研究在國內(nèi)鮮見報道。本試驗從化感作用的角度揭示桃金娘是否適合在林下種植，以及2種植物種間是否有良好的生化關(guān)系，探討銀杏葉和根系分解釋放的物質(zhì)在進入土壤物質(zhì)循環(huán)后，對受體植物桃金娘生長所產(chǎn)生的綜合影響如何。本研究采用盆栽試驗，以桃金娘為受體，模擬自然界中銀杏葉和根在土壤內(nèi)分解過程中對其生長的影響，以期為銀杏葉、根對桃金娘化感作用的深入研究提供參考依據(jù)，將對銀杏農(nóng)林復(fù)合模式中搭配樹種的科學(xué)選擇具有重要的借鑒和參考。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗材料為銀杏葉和根，取自福建省龍巖市長汀縣策武鎮(zhèn)南坑村21年生銀杏園，收集銀杏葉，取表層土20 cm以下根系，所取樣品采用裝有冰袋的－4℃便攜式保溫箱低溫保存帶回實驗室。取完后將土覆蓋回原處，避免影響銀杏的正常生長;試驗受體植物材料為3年生桃金娘，購自沭陽縣新泰綠化苗木公司(采用種子播種，大棚規(guī)?；N植)。參試桃金娘植株選擇生長情況基本一致的健康苗木，平均苗高60～63 cm，平均地徑0.9～1.3 cm。選擇栽培基質(zhì)(草炭土 ∶黃壤 ∶細沙為2∶6∶2)將其充分混勻，平鋪晾至2 d待用，盆栽試驗的栽植容器為上口徑27 cm、高20 cm的塑料盆缽，每盆裝土7 kg，每盆栽種2株桃金娘。
1.2 方法
1.2.1 銀杏葉和根浸提液的制備 采用單因素試驗法，將收集的銀杏葉和根用清水洗凈泥土、晾干、剪碎，隨機取100 g放置于燒杯中，加入1 L蒸餾水搖勻用保鮮膜封住瓶口，放置48 h后，用紗布將葉和根系過濾取上清液，配制成0.10 g·mL－1提取液，將提取液放置于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 盆栽試驗的布設(shè) 以蒸餾水為對照(CK)，將所制得的銀杏葉浸提液提取稀釋成 0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 g·mL－1不同梯度試驗品，標記為試驗1～5，銀杏根浸提液提取稀釋成0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 g·mL－1不同梯度試驗品，標記為試驗6～10，以蒸餾水為對照(CK)，標記為試驗11(表1)。每個濃度梯度試驗設(shè)置3盆重復(fù)，11組試驗共33盆。2017年3月10日在福建農(nóng)林大學(xué)科研園區(qū)種植試驗苗，溫室培養(yǎng)溫度(20±5)℃，光照強度 300 μmol·m－2·s－1，晝夜光照時間:12 h/12 h。將浸提液從冰箱取出，放置常溫后，用銀杏葉和根的不同梯度浸提液分別澆灌桃金娘苗木，一次性澆透，之后每3 d澆1次，每盆500 mL，保證土壤含水量在20%～30%。培育期間進行正常的管理培養(yǎng)。
1.2.3 指標測定
1.2.3.1 桃金娘生長量測定時間 處理前(3月10日)測定桃金娘苗高和地徑，處理3個月后(2017年6月10日)，測定其苗高和地徑。
1.2.3.2 桃金娘生長量測定 采用游標卡尺測量桃金娘苗高和地徑(苗高測量精度±3.50 cm;地徑測量精度±0.20 cm)。
1.2.3.3 葉綠素?zé)晒鉁y定 采用 Handy Fluor Cam熒光成像儀(Photon Systems Instruments公司生產(chǎn))測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，選取主莖上完全展開的桃金娘葉子進行測定，每個處理組重復(fù)測定3次。在測定前先對葉片進行20 min暗反應(yīng)處理，測定指標為最小熒光變量(minimal fluorescence，F(xiàn)o)、最大熒光變量(maximum fluorescence，F(xiàn)m)、可變熒光(variable fluorescence，F(xiàn)v)、最大光能轉(zhuǎn)換效率(maximal photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm)、PSⅡ潛在活性(potential photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fo)［13］。
1.2.3.4 酶活性含量測定 盆栽土壤酶活性測定方法［14-17］采用新鮮土樣測定，土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸法，土壤脲酶活性采用次氯酸鈉比色法，蛋白酶活性采用茚三酮比色法，纖維素酶的活性測定采用蒽酮比色法，過氧化物酶活性采用沒食子酸比色法，多酚氧化酶活性采用沒食子酸比色法，酸性磷酸酶活性測定采用苯酚鈉比色法。
1.3 數(shù)據(jù)處理
用Microsoft Excel 2003進行原始數(shù)據(jù)處理，利用SPSS Statistics 18.0進行單因素方差分析(Oneway ANOVA)和LSD多重比較分析以及Pearson相關(guān)性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 浸提液對桃金娘生長的影響
銀杏葉和根浸提液對桃金娘生長的影響見表1。由表1可知，由于桃金娘苗木購自苗木公司，植株生長情況不能保持完全一致，對苗木的生長量測定試驗產(chǎn)生了一定影響。3月初種桃金娘時，試驗4、5、10的試驗苗的苗高有一定差距，11組試驗苗的地徑差異性顯著。6月測定桃金娘苗木生長3個月后的狀況，11組試驗苗的苗高差異性不顯著，地徑差異性顯著。由試驗苗增長量可知，桃金娘苗木的苗高增長量差異性顯著，試驗4的增長量最大，試驗9、10的增長量最小;地徑增長量差異性顯著，試驗2的增長量最大，試驗9、10的增長量最小，低濃度的銀杏根浸提液(試驗9、10)對苗木的苗高、地徑的增長作用不明顯，11組試驗苗未出現(xiàn)生長停滯和枯死現(xiàn)象，說明了銀杏葉和根浸提液對桃金娘苗木的生長抑制作用不顯著。由于試驗時間(3個月)過短和試驗苗木本身存在顯著性差異，對本試驗的測量結(jié)果影響很大，不能明確判斷出浸提液對桃金娘苗高、地徑的生長影響是否顯著;不同濃度同一器官的浸提液處理對桃金娘生長的影響顯著性判斷依據(jù)不足，因此，對本試驗中銀杏浸提液對桃金娘生長的影響進行下一步探究。
2.2 銀杏葉和根浸提液對桃金娘葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
圖1顯示了銀杏葉和銀杏根不同濃度浸提液對桃金娘葉最小熒光變量Fo、最大熒光變量Fm、可變熒光Fv、最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/Fo這 5 個指標的影響。處理 1、2、6、7、8 的最小熒光變量Fo均＜處理11，其中:處理1比處理11減少 4.72%、處理 8 比處理 11 減少 4.04%;處理 3、4、5、9、10的最小熒光變量Fo均高于處理11，其中:處理5比處理11增加20.27%、處理10比處理11增加13.12%。銀杏葉和根不同濃度浸提液對Fo影響較大，處理5和處理4、10差異性不顯著，和其余8組處理結(jié)果差異達顯著水平。最大熒光變量Fm的變化和最小熒光變量 Fo相似，處理 1、2、3、6、7、8 的最大熒光變量Fm均＜處理11，其中:處理2比處理11減少4.81%、處理 8 比處理 11 減少6.17%;處理 4、5、9、10的最大熒光變量Fm均高于處理11，其中:處理 4 比處理 11 增加 3.47%、處理10比處理11增加3.79%，表明不同濃度浸提液對Fm影響較小。處理 1、2、3、5、6、7、8 的可變熒光(Fv)均低于處理11，其中:處理2比處理11減少4.80%、處理 7 比處理 11 減少6.31%;處理 4、9、10的可變熒光(Fv)均高于處理11，其中:處理4比處理11增加3.47%、處理10比處理11增加3.79%。以上最小熒光變量Fo、最大熒光變量Fm和可變熒光Fv3個指標均呈現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，最大光能轉(zhuǎn)換效率和PSⅡ潛在活性，在非脅迫條件下，該參數(shù)的變化極小，不受生長條件的影響，只有在脅迫條件下該參數(shù)明顯下降。銀杏葉和根在相同濃度的提取液澆灌影響下，桃金娘葉綠素?zé)晒饨Y(jié)果呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，從各試驗的最大影響結(jié)果來看:最小熒光變量(Fo)試驗中，處理5(20.27%)＞處理10(13.12%);最大熒光變量(Fm)試驗中，處理 2(4.81%)＜處理 8(6.17%);可變熒光(Fv)試驗中，處理 2(4.80%)＜處理 7(6.31%);最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)試驗中，處理 5(3.09%)＞處理 10(1.18%);PSⅡ潛在活性 Fv/Fo試驗中，處理 5(21.59%)＞處理 10(8.99%)，銀杏葉浸提液在最小熒光變量Fo、最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/Fo3組試驗中影響比銀杏根浸提液顯著，銀杏根浸提液在最大熒光變量Fm、可變熒光Fv2組試驗中影響比銀杏葉浸提液顯著，即銀杏葉和根浸提液對桃金娘葉綠素?zé)晒饩胁煌潭鹊挠绊?。由?可知，最大熒光變量Fm和可變熒光Fv試驗差異性不顯著，最小熒光變量Fo、最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/Fo試驗差異性顯著。
表 1 桃金娘生長狀況［1，2］Table 1 Growth status of Rhodomyrtus tomentosa
圖1 葉綠素?zé)晒鈭D譜Fig.1 Chlorophyll fluorescence spectrum
2.3 銀杏葉和根浸提液對酶活性的作用
圖2和表3顯示了銀杏不同濃度浸提液對桃金娘土壤纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶這7個酶活性指標的影響。
纖維素酶活性試驗，處理 3即 0.025 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的桃金娘土壤中纖維素酶活性值最大，處理2即0.05 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的土壤中纖維素酶活性值最小，其中:處理2和處理11(CK)差異不顯著(P＞0.05)，處理3比處理11增加59.34%，除處理 2比處理 11減少 1.56%，其余 8組處理纖維素酶活性均比處理11增加，同時和處理11差異顯著(P＜0.05)，除處理3外，同一濃度處理的銀杏葉和根浸提液(處理1和處理6、處理2和處理7、處理4和處理9、處理5和處理10)對纖維素酶活性影響差異不顯著(P＞0.05)。
蔗糖酶活性試驗，處理 6即0.1 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的桃金娘土壤中蔗糖酶活性值最大，處理10即0.006 25 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中蔗糖酶活性值最小，其中:處理10比處理11減少36.64%，處理1～9比處理 11增加 52.31%～279%，處理6、7、8和處理11的蔗糖酶活性結(jié)果差異性顯著，即銀杏根提取液處理酶活性差異性極顯著(P＜0.01)，說明銀杏葉浸提液對蔗糖酶活性影響較大。
表2 葉綠素?zé)晒怙@著性分析［3］Table 2 Significance analysis of chlorophyll fluorescence
圖2 酶活圖譜Fig.2 Enzyme activity
脲酶活性試驗，處理 10 即 0.006 25 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的桃金娘土壤中脲酶活性值最大，處理9即0.012 5 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中脲酶活性值最小，總體呈現(xiàn)“U”字形曲線，其中:處理10比處理11增加了12.09%，其余9組處理脲酶活性均比處理11減少，處理9比處理11減少了80.47%，銀杏葉和根浸提液對脲酶活性均有一定影響，脲酶活性差異性極顯著(P＜0.01)，同一濃度浸提液處理銀杏根浸提液對脲酶活性影響更大。
酸性磷酸酶活性試驗，處理3即0.025 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的桃金娘土壤中酸性磷酸酶活性值最大，處理 7 和 9 即 0.05 g·mL－1和0.0125 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中酸性磷酸酶活性值最小，總體呈現(xiàn)出“W”形趨勢，其中:處理1比處理11增加了0.85%，處理3比處理11增加了2.74%，其余處理均比處理11減少，同一濃度處理，銀杏根浸提液對酸性磷酸酶活性抑制作用較大。
多酚氧化酶活性變化，總體呈現(xiàn)“低促高抑”趨勢，處理8即0.025 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的桃金娘土壤中多酚氧化酶活性值最大，處理1即0.1 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的土壤中多酚氧化酶活性值最小，其中:高濃度提取液抑制多酚氧化酶活性，處理1～4 和處理 6、7、9 比處理 11 減少了0.47%～60.76%，低濃度提取液促進多酚氧化酶活性，處理5、8、10比處理11增加了0.46%～10.28%，多酚氧化物酶活性差異性極顯著(P＜0.01)。
過氧化物酶活性試驗，處理11即對照組(CK)澆灌的桃金娘土壤中過氧化物酶活性值最大，處理3即0.025 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的土壤中過氧化物酶活性值最小，其中:10組處理均比處理11減少，處理 6、7、8 比處理 11 減少 56.71%～66.16%，處理3比處理11減少79.36%，高濃度銀杏根提取液澆灌下過氧化物酶活性處理值同處理11呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，即在同一濃度處理，銀杏根浸提液對過氧化物酶活性抑制作用較大。
表3 酶活顯著性分析Table 3 Significance analysis of enzyme activity
蛋白酶活性試驗，處理1即 0.1 g·mL－1銀杏葉提取液澆灌的桃金娘土壤中蛋白酶活性值最大，處理9即0.012 5 g·mL－1銀杏根提取液澆灌的土壤中蛋白酶活性值最小，其中銀杏葉浸提液對蛋白酶活性影響較大，處理1比處理11增加138.32%，處理2比處理11增加 118.47%，處理 6比處理 11增加111.64%，處理 9 比處理 11 減少 36.15%，差異性極顯著(P＜0.01)。
在低濃度浸提液處理下，即試驗 4、5、9、10，纖維素酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶對照之間差異不顯著，中、高濃度浸提液處理下試驗1～3、6～8對這7種酶的活性均有不同程度的影響，高濃度的銀杏葉浸提液，試驗1將纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶活性增強了 9.44%、52.71%、－45.13%、0.87% 、－37.80%、－17.28%、138.32%;高濃度的銀杏根浸提液，試驗6將纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶活性增強了11.70%、279.04%、－50.98%、－ 1.84%、－ 2.85%、－ 60.80%、111.64%，銀杏根浸提液對酶活性響應(yīng)較大。
3 結(jié)論與討論
銀杏葉和根浸提液對葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)不顯著，葉浸提液對酶活性響應(yīng)不顯著，根浸提液對酶活性響應(yīng)較大。不同濃度浸提液澆灌下，桃金娘呈生長態(tài)勢，因此，銀杏和桃金娘二者為互利效應(yīng)，銀杏農(nóng)林復(fù)合模式中可以搭配桃金娘，將對銀杏林林下復(fù)合模式生態(tài)環(huán)境修復(fù)和發(fā)展林下經(jīng)濟具有重要的借鑒和參考。
銀杏葉和根浸提液對桃金娘植株生長均起到了促進作用，同一濃度不同器官的浸提液處理，根浸提液對桃金娘苗高、地徑的生長影響不顯著;不同濃度同一器官的浸提液處理對桃金娘生長的影響不顯著。陳虹霞［12］等研究低濃度銀杏葉聚戊烯醇提取物能夠促進小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，高濃度提取物對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長呈現(xiàn)抑制作用;劉冬杰［18］等研究隨著刺槐枯落葉浸提液濃度的增大，對種子發(fā)芽、幼苗生長的抑制作用強度增大;范淑英［19］等研究低濃度浸提液對幼苗生長起促進作用。本研究結(jié)果不一致的原因可能是試驗時間過短，桃金娘植株生長量小，促進抑制作用不顯著。因此，需要進行更長一段時間的研究。
作物產(chǎn)量和植物生物量形成的生理基礎(chǔ)是光合作用，其中葉綠素?zé)晒鈪?shù)常用來判斷植物光合作用受到逆境脅迫的傷害，如今植物體內(nèi)的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)研究已成為熱點，在植物逆境生理研究中得到廣泛的應(yīng)用［20］。葉綠素?zé)晒庑盘柊素S富的光合作用過程變化的信息，在林木栽培、林木逆境生理等方面的應(yīng)用較廣［21-22］。本試驗最小熒光變量Fo、最大熒光變量Fm、可變熒光Fv這3個指標呈現(xiàn)出“低促高抑”趨勢，最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm是0.83～0.86，試驗組和 CK 試驗相比是降低的趨勢，與陳辰［23］等植物葉綠素?zé)晒?Fv/Fm一般在0.75～0.85，植物在脅迫生長條件下，葉綠素?zé)晒釬v/Fm降低，PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)化過程不成為其限制因子的結(jié)果相同;與李曼［24］等在 3.0 mg·L－1BPA 可降低大豆和玉米初始熒光Fo，PSⅡ中心受損，光能轉(zhuǎn)化和電子傳遞效率降低的結(jié)果，以及王春晴［25］等研究木麻黃浸提液處理下青皮苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)中Fo、Fv/Fm、Fv/Fo等存在顯著差異的結(jié)果相同。植物在脅迫生長條件下，即高濃度浸提液試驗，桃金娘葉綠素?zé)晒鈪?shù)降低，說明銀杏浸提液對桃金娘植株生長有一定影響。
土壤酶活性與植物生長、植物抗逆性生理密切相關(guān)，是土壤生物性能的一種最穩(wěn)定和最敏感的指標，是測定土壤污染所導(dǎo)致的各種變化的一種生物學(xué)方法［26-27］。本試驗結(jié)果中纖維素酶活性略有增強，蔗糖酶和蛋白酶活性同周玉祥［28］等研究酶活性的趨勢變化結(jié)果相同，蔗糖酶能為土壤生物體提供充分能源，增加易溶性營養(yǎng)物質(zhì)，反映了土壤有機碳累積與分解轉(zhuǎn)化的規(guī)律，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越強;蛋白酶活性通常被認為是依賴于土壤微生物生物量水平，土壤蛋白酶活性提高，與本研究中加入的銀杏浸提液提高了土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量有關(guān)，具體需進行微生物試驗研究。脲酶和酸性磷酸酶與土壤氮、磷循環(huán)相關(guān)，脲酶活性在浸提液的影響下顯著減少，高濃度浸提液對活性破壞較大，同賈麗琴［29］等的研究結(jié)果脲酶活性顯著提高不同，低濃度浸提液能夠提高脲酶活性，高濃度則是抑制作用，有待于進一步試驗證明;酸性磷酸酶活性呈現(xiàn)“W”形曲線，低濃度浸提液處理和CK處理差異性不顯著;多酚氧化酶活性呈現(xiàn)“低促高抑”趨勢;過氧化物酶活性呈現(xiàn)減少趨勢，根浸提液試驗對酶活性的影響較大，同倪學(xué)文［30］等研究銀杏外種皮酚酸含量更高的結(jié)果相近，銀杏種皮含有的化感物質(zhì)是否更高，有待下一步的研究證明。
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