桃金娘多糖的提取及抗氧化活性的分析

黃麗華 翁玉瑩 陳剛

(肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)，又稱山稔子、崗稔、當(dāng)梨，為桃金娘科桃金娘屬，常綠矮小木本植物，多為野生狀態(tài)。桃金娘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、萜類、多糖、黃酮類、酚類等多種化學(xué)成分，有預(yù)防壞血病，增強(qiáng)人體抵抗力，預(yù)防肝癌、肝炎，抗氧化衰老，降血脂等作用[1,2]。因此，桃金娘果實(shí)具有較高的研究?jī)r(jià)值，廣闊的開發(fā)前景。

植物多糖在生物體內(nèi)具有提高人體抵抗力、抗衰老、抗腫瘤等作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，桃金娘多糖具有保肝降酶[4]、抗氧化[5]等作用。目前，在中國(guó)國(guó)內(nèi)關(guān)于桃金娘多糖及其抗氧化性的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)將通過浸提溫度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)桃金娘果實(shí)多糖提取工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)多糖提取液的體外抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)分析，為桃金娘在藥用、食用及作為飼料添加劑等方面的開發(fā)利用提供科學(xué)研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

桃金娘干果(購(gòu)自湛江特產(chǎn)店)；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；722型可見分光光度計(jì)(上海美譜儀儀器有限公司)；ALC-210-2電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；ZKJ-1型真空泵(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 多糖提取方法

1.2.1 桃金娘果實(shí)多糖的提取工藝流程

桃金娘果實(shí)粉末→水浴浸提→抽濾→多糖粗濾液→Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=1∶4)除蛋白[6]→離心→濾液→稀釋→測(cè)吸光度、計(jì)算多糖得率。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

固定料液比為1∶30，浸取時(shí)間為4h，探討水浴溫度為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃對(duì)桃金娘果實(shí)多糖提取率的影響。

固定料液比為1∶30，溫度為70℃，探討浸提時(shí)間為2h、3h、4h、5h、6h對(duì)桃金娘果實(shí)多糖提取率的影響。

固定溫度為70℃，浸取時(shí)間為4h，探討料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g·mL-1)，對(duì)桃金娘果實(shí)多糖提取率的影響。

重復(fù)測(cè)3次，取平均值。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取水浴溫度、浸提時(shí)間、料液比3個(gè)因素采用L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)化多糖的提取工藝，并根據(jù)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.4 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[7]。

1.3 抗氧化活性分析[8]

1.3.1 總還原能力的測(cè)定

參照趙芷車等[9]的測(cè)定方法。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照黃麗華等[10]的測(cè)定方法。

1.3.3 羥自由基清除能力的測(cè)定

采用分光光度法及參照Fenton反應(yīng)體系[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后，得出回歸方程:

Y=13.751x-0.0114

相關(guān)系數(shù)R2=0.9944。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)桃金娘果實(shí)多糖得率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，多糖不斷地溶解出來，使得多糖得率逐漸升高。在90～100℃，多糖得率出現(xiàn)急劇增加的現(xiàn)象，這可能是由于溫度的升高，加快了分子的運(yùn)動(dòng)，加快了水溶性多糖的溶出[11]。由此可知，桃金娘多糖提取溫度為100℃左右為宜。

2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)桃金娘果實(shí)多糖得率的影響

由圖3可知，提取時(shí)間在2～5h時(shí)，多糖的提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，在5h之后，多糖的提取得率逐漸降低。這可能是由于提取時(shí)間過久，改變了多糖的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖提取得率下降[12]。由此可知，桃金娘多糖的提取時(shí)間應(yīng)為5h左右為宜。

2.2.3 料液比對(duì)桃金娘果實(shí)多糖得率的影響

由圖4可知，在料液比為1∶10～1∶20時(shí)，多糖的提取得率隨之上升，在料液比為1∶20(g·mL-1)之后，多糖的提取得率隨料液比的增加而逐漸降低，這可能是由于料液比增大，使溶液過稀，導(dǎo)致多糖得率下降。因此，桃金娘多糖提取的料液比為1∶20(g·mL-1)左右為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析[13]

由表1、2可知，溫度對(duì)桃金娘果實(shí)多糖提取影響最顯著，料液比對(duì)桃金娘果實(shí)多糖提取的影響最小。3個(gè)因素的主次排序：A溫度>B提取時(shí)間>C料液比，水浸提取桃金娘果實(shí)多糖的最佳組合為C3A1B3。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)方差分析

2.4 最優(yōu)提取條件的驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)最佳組合條件對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行測(cè)3次。結(jié)果顯示，保持其它條件不變的情況時(shí)，在最優(yōu)提取條件組合下，多糖得率分別為2.38%、2.43%、2.40%，平均數(shù)為2.40%。因此，水浸提取桃金娘果實(shí)多糖的最優(yōu)方案為：溫度80℃、提取時(shí)間6h、料液比1∶30(g·mL-1)。

2.5 桃金娘果實(shí)多糖提取液的抗氧化活性分析

2.5.1 桃金娘果實(shí)多糖提取液的總還原力分析

由圖5所示，試驗(yàn)采用Oyaizu法，通過觀察添加不同濃度多糖提取物后Fe3+和Fe2+之間的轉(zhuǎn)移來檢測(cè)樣品的還原能力，因?yàn)橐环N物質(zhì)的還原能力與其潛在的抗氧化活性關(guān)系密切。桃金娘多糖提取液具有一定的總還原力，隨著樣品濃度的增加，吸光度增大，兩者呈劑量依賴關(guān)系，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)[14,15]。樣品濃度(X)與吸光度(Y)間的回歸方程為Y=2.185X+0.017，R2=0.9848。其總還原能力明顯弱于維生素C。

2.5.2 桃金娘果實(shí)多糖提取液對(duì)DPPH自由基清除能力的分析

由圖6可知，多糖對(duì)DPPH·有較強(qiáng)的清除作用，在質(zhì)量濃度為0.125～1.00mg·mL-1范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，清除率逐漸增加，當(dāng)多糖濃度≥0.5時(shí),對(duì)DPPH·清除率與維生素C相當(dāng)，其IC50為0.15mg·mL-1。

2.5.3 桃金娘果實(shí)多糖提取液對(duì)OH自由基清除能力的分析

由圖7可見，桃金娘多糖對(duì)·OH具有清除能力，隨著多糖濃度的逐漸升高，其清除能力在緩慢提升。由此可見，桃金娘多糖具有一定的清除能力，但與維生素C相比還有一定的差距,其IC50為0.50mg·mL-1。

3 小結(jié)與討論

上述研究可知，溫度、提取時(shí)間、料液比等因素對(duì)桃金娘果實(shí)多糖的提取有一定影響，其中溫度的影響最為顯著。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)法對(duì)桃金娘果實(shí)中多糖的工藝流程進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，桃金娘果實(shí)多糖提取最佳條件為溫度80℃，提取時(shí)間6h，料液比1∶30(g·mL-1)；最佳條件下桃金娘果實(shí)多糖提取率為2.40%。

數(shù)據(jù)表明，桃金娘果實(shí)多糖的提取液具有較好的抗氧化能力，多糖對(duì)DPPH、羥基自由基均具有顯著的清除活性，且其能力隨多糖濃度的升高而增強(qiáng)，其IC50分別為0.15mg·mL-1、0.5mg·mL-1,桃金娘多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用最為顯著，當(dāng)多糖濃度為0.5mg·mL-1時(shí)，清除能力達(dá)到了93.27%，與維生素C對(duì)DPPH自由基清除率相當(dāng)。因此桃金娘是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，本研究為進(jìn)一步開發(fā)利用桃金娘提供理論依據(jù)。