利用膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建人尿道上皮細(xì)胞cDNA文庫

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(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

1989年由Fields等最早提出來的酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)是用來檢測細(xì)胞核內(nèi)的蛋白之間的相互作用。而瑞士Dual systems Biotech AG公司開發(fā)了一種新的基于分離的泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)(DUAL membrane starter kit)，該系統(tǒng)可以簡便、快速、特異地用于檢測膜蛋白之間的相互作用[1-3]。

生殖支原體、沙眼衣原體等泌尿生殖道感染病原體主要通過與宿主細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體蛋白相互作用而感染或侵入宿主細(xì)胞[4]。當(dāng)無限傳代的人永生化尿道上皮細(xì)胞系(SV40 Immortalized human urothelium cell line，SV-HUC-1)傳到第20代的時(shí)候，依然可以檢測到其標(biāo)志性的蛋白，因此，該細(xì)胞是研究泌尿道組織細(xì)胞的理想細(xì)胞[5]。鑒于目前國內(nèi)外尚未見關(guān)于泌尿生殖道感染病原體是與人尿道上皮細(xì)胞哪些受體蛋白相互作用，因而介導(dǎo)其黏附或侵入細(xì)胞的報(bào)道，因此，本研究擬通過合成人尿道上皮細(xì)胞的cDNA, 利用膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建SV-HUC-1細(xì)胞的cDNA文庫，為下一步研究泌尿生殖道感染病原體的受體及其與宿主細(xì)胞的相互作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料Trizol試劑購自Initrogen公司，Oligotex mRNA Kits購自于Qiagen公司，1 kb Plus DNA Ladder和UltraPure Agarose為上海?？粕锕井a(chǎn)品，Supscript double stand cDNA Kit購自Invitrogen公司；臺式高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5417R)為Eppendorf公司產(chǎn)品，PCR儀和MicroPulser電轉(zhuǎn)化儀(1652100)為Biorad公司產(chǎn)品。

1.2 Trizol法提取細(xì)胞總RNA 提取細(xì)胞總RNA，步驟簡述如下：收集培養(yǎng)好的細(xì)胞樣本，加入2.0 mL Trizol，室溫靜置5 min；加入4 mL酚-氯仿，12 000 g，4 ℃離心10 min，再加入4 mL異丙醇，12 000 g，4 ℃離心15 min，棄上清后用5 mL 75%乙醇洗沉淀2次，并用500 μL DEPC水溶解，取1 μL用于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，其余-80 ℃保持備用。

1.3 mRNA的分離細(xì)胞mRNA的分離按Oligotex mRNA Kits的說明書進(jìn)行，其步驟簡述如下：將總RNA轉(zhuǎn)移到無RNA酶的EP管中，向其中加入經(jīng)70 ℃預(yù)熱的OBB緩沖液，混勻后立即置于70 ℃水浴3 min，然后在20～30 ℃中放置10 min，室溫離心2 min后棄上清，用400 μL的OW2 Buffer重懸沉淀，混勻后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心柱上經(jīng)14 000 g離心1 min，轉(zhuǎn)移到一新的離心管后加入100 μL的DEPC水(70 ℃預(yù)熱)，混勻后14 000 g離心1 min，轉(zhuǎn)移離心柱(Millpore公司)至新的1.5 mL離心管中加入400 μL的OW2緩沖液，離心1 min后重復(fù)上一步驟，再用水洗脫一次，合并兩次的洗脫液，加入60 μL 2 mol/L的乙酸鈉和600 μL無水乙醇，混勻后于-80 ℃中放置15 min，離心15 min，用75%乙醇洗一遍，再次離心后溶于8 μL的DEPC水，取1 μL電泳檢測并測其OD值。

1.4 cDNA的合成將4.5 μg分離純化的mRNA補(bǔ)體積至22.5 μL，加入DEPC水3 μL和2 μL 3′ RT引物，置于PCR儀上70 ℃處理7 min后置于冰上；同時(shí)在另一個無RNA酶的EP管中加入10 μL 5×RT Buffer、5 μL水和2.5 μL 10 mmol/L的dNTPs和5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶。待引物反應(yīng)管降至45 ℃時(shí)孵育2 min，將其加入上述PCR反應(yīng)體系中，混勻，置于50 ℃孵育1 h，即生成第一鏈cDNA。加入Glycogen (20 μg/μL)、NH4OAc(7.5 mol/L)和無水酒精于-80 ℃沉淀，16 000 g，4 ℃離心30 min，棄上清后加入70%酒精，離心后室溫干燥并用66 μL DEPC水溶解cDNA。再通過DNA聚合酶合成cDNA相應(yīng)的第二條鏈，然后加入160 μL酚-異戊醇-氯仿混合物，離心5 min，用乙醇沉淀上清，再用34 μL DEPC水溶解。

1.5 cDNA與載體的連接將cDNA產(chǎn)物與T4 DNA連接酶于16 ℃孵育24 h，以將cDNA末端連接上5′ A接頭，經(jīng)T4 DNA聚合酶將其補(bǔ)平，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收大于1 kbp片段后用DEPC水溶解。將7 μL cDNA與3 μL經(jīng)酶切處理線性化的pPR3-N載體混合，加入5 μL Infusion重組酶和5 μL DEPC水，混勻后于50 ℃反應(yīng)1 h，加入2 μL蛋白酶K和78 μL無菌水，混勻并于-80 ℃放置1 h，加入Glycogen (20 μg/μL)、NH4OAc(7.5 mol/L)和無水酒精于-80 ℃沉淀，離心后用乙醇洗滌，最后用10 μL DEPC水重懸cDNA沉淀。

1.6電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞將2.5 μL重組產(chǎn)物和50 μL感受態(tài)細(xì)胞加入-80 ℃預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯，于電轉(zhuǎn)化儀上電擊后迅速加入1 mL LB培養(yǎng)基，將4份轉(zhuǎn)化后菌液合并后補(bǔ)足培養(yǎng)基到5 mL，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h，將培養(yǎng)物稀釋101、102、103、104倍，分別取10 μL涂板。

1.7膜蛋白酵母雙雜交文庫的質(zhì)量鑒定將10 μL轉(zhuǎn)化后細(xì)菌原液稀釋1 000倍后，取10 μL涂布在含氨芐抗性的LB平板上，24 h后計(jì)數(shù)，以鑒定文庫的庫容量。為了鑒定插入片段的大小，隨機(jī)在平板上挑取24個單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序后進(jìn)行BLAST比對以分析其是否為人源性。

2 結(jié) 果

2.1成功提取SV-HUC-1細(xì)胞的總RNA 提取了SV-HUC-1細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示：所提取的RNA出現(xiàn)兩條清晰的條帶，無降解，18sRNA條帶亮度大約為28sRNA條帶的亮度的1/2，這說明提取的SV-HUC-1細(xì)胞RNA質(zhì)量較好，完全滿足后續(xù)構(gòu)建文庫的需要。

圖1 SV-HUC-1細(xì)胞總RNA的瓊脂糖凝膠電泳1：Total RNA；M：DNA Marker

2.2成功分離SV-HUC-1細(xì)胞的mRNA 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析經(jīng)Oligotex mRNA Kits分離純化的mRNA，如圖2所示：mRNA呈彌散灶分布，條帶清晰且分布均勻，說明分離的mRNA質(zhì)量合格。根據(jù)測定的OD值計(jì)算，mRNA的總量約為5.1 μg，說明成功分離到SV-HUC-1細(xì)胞的mRNA，且分離的量可以滿足后續(xù)建庫需要。

2.3構(gòu)建的膜蛋白酵母雙雜交文庫具有較高的庫容為了檢測文庫的庫容，將10 μL原始電轉(zhuǎn)化菌液稀釋100倍后，取10 μL涂板，平板上共長出240個克隆，共有5 mL原始電轉(zhuǎn)化菌液，因此，總庫容量為：240/10×100×1000×5=1.2×107CFU，說明構(gòu)建的文庫具有較高的庫容。

圖2 人永生化尿道上皮細(xì)胞mRNA的分離與純化1：mRNA；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.4構(gòu)建的膜蛋白酵母雙雜交文庫具有高的重組率和隨機(jī)性為進(jìn)一步鑒定文庫的重組率和隨機(jī)性，對隨機(jī)挑取的24個單克隆進(jìn)行PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3所示：24個克隆均擴(kuò)增成功，其重組率達(dá)到了100%；且由圖可知，插入的片段長度處于400～2 000 bp之間，其平均長度約為1.2 kbp左右，說明文庫具有較好的隨機(jī)性[7]。BLAST分析表明這些外源插入片段均為人源性。

圖3 SV-HUC-1細(xì)胞cDNA文庫隨機(jī)克隆的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳1～23：PCR產(chǎn)物；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3 討 論

泌尿系感染通?？蓪?dǎo)致不孕不育、急慢性非淋菌性尿道炎[6]、子宮內(nèi)膜炎等疾病。且有相關(guān)資料表明生殖支原體、穿透支原體等泌尿生殖道支原體與人類免疫缺陷病毒(HIV)的感染密切相關(guān)[7-8]。因此，近年來，泌尿生殖道病原體感染越來越引起人們的廣泛關(guān)注。

病原體感染或侵入宿主細(xì)胞依賴于病原體和宿主胞膜上相應(yīng)受體蛋白的作用，因此，病原體的組織親嗜性是由病原體的黏附蛋白和宿主細(xì)胞的受體蛋白的特異結(jié)合決定的。通過深入研究能與病原體特異結(jié)合的宿主細(xì)胞膜表面的受體，有助于了解病原體的致病機(jī)制，并可利用受體模擬分子或者拮抗分子來阻擋病原體黏附或侵入宿主細(xì)胞，從而開發(fā)出新型藥物或者疫苗防治病原體感染。

免疫共沉淀技術(shù)、親和蛋白組學(xué)技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)等都可用于研究病原體與宿主細(xì)胞相應(yīng)受體蛋白之間的相互作用。其中由Fields等在1989年提出的酵母雙雜交技術(shù)是現(xiàn)在研究蛋白質(zhì)相互作用的最有效的手段之一[4]，該方法利用誘餌和獵物蛋白相互作用的報(bào)告基因，判斷特定蛋白之間有無相互作用[9]。由于是在細(xì)胞核內(nèi)融合蛋白通過相互作用而激活轉(zhuǎn)錄，因此經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)并不可以用于膜蛋白之間的研究，而瑞士Dual systems Biotech AG公司開發(fā)的基于分離的泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)(DUAL membrane starter kit)無需核定位信號、且泛素蛋白對具有相互作用的蛋白的影響很小，可檢測膜蛋白與其它蛋白之間的相互作用[10-12]。因此，基于分離的泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)目前已廣泛用于尋找病原菌與宿主細(xì)胞受體蛋白的相互作用。如Grefen C等利用該方法證實(shí)肺炎衣原體CPj0783蛋白能夠識別人Huntingtin-protein14蛋白[13]痢疾桿菌的IpaC蛋白可以與人膠原酶蛋白發(fā)生相互作用，提示膠原蛋白酶可能是痢疾桿菌的受體作用靶點(diǎn)[14]。

為了闡明泌尿生殖道感染病原體與宿主細(xì)胞受體蛋白相互作用的關(guān)系及其可能的致病機(jī)制，本研究利用基于分離的泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建了SV-HUC-1的cDNA文庫。在研究中，我們使用同源重組的方式將合成的cDNA與經(jīng)酶切處理線性化的pPR3-N載體進(jìn)行連接，由于線性化的DNA兩端與基因組DNA的多處序列具有同源性，因而后續(xù)的重組連接更準(zhǔn)確，該重組方法整合了其它公司所用連接方法的優(yōu)點(diǎn)步驟相對簡單，克服了其連接效率低的缺點(diǎn)，從而大大提高了文庫質(zhì)量[15]，且方便今后將該文庫樣本構(gòu)建到任何其它載體上。本研究中構(gòu)建的cDNA文庫的庫容達(dá)到了1.2×107，一般而言，如果文庫的平均滴度在5×106～1×107之間，則表明文庫的質(zhì)量較好，且本研究中構(gòu)建的文庫具有很高的重組率和隨機(jī)性，因此，本研究成功構(gòu)建了基于分離泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)的SV-HUC-1 cDNA文庫，為進(jìn)一步研究泌尿生殖道感染病原體與宿主細(xì)胞的相互作用，闡明泌尿生殖道感染病原體感染宿主細(xì)胞的致病機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。我們在下一步的研究將利用此文庫篩選生殖支原體、沙眼衣原體和淋病奈瑟菌等常見泌尿生殖道感染病原體的受體蛋白，以明確這些病原體與宿主受體蛋白的相互作用、闡明其可能的致病機(jī)制。