李珉，張莉，余婷婷，范志勇

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430000）

維生素 A、D、E極性較弱不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，屬于脂溶性維生素(Fat Soluble Vitamins)，是人體必需的營養(yǎng)素，在食品及保健食品領(lǐng)域的研究和應(yīng)用非常廣泛。食用油脂中天然脂溶性維生素含量高低是評價(jià)油品品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值的重要參數(shù)，維生素A、D作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑用于食用油中可提高其營養(yǎng)價(jià)值，維生素E在油脂加工中作為天然抗氧化劑防止油脂氧化，保障油品品質(zhì)。保健食品中以油脂為載體加入維生素A、D、E用以預(yù)防夜盲癥、佝僂病和抗衰老等[1]。然而，脂溶性維生素在高溫、高濕、光照、和極端pH值條件下易發(fā)生轉(zhuǎn)化，若在食品加工儲(chǔ)存環(huán)節(jié)流失嚴(yán)重，則無法達(dá)到預(yù)期的營養(yǎng)強(qiáng)化目的。同時(shí)脂溶性維生素的過量攝入還存在著蓄積中毒的風(fēng)險(xiǎn)，如維生素A攝入過量可能導(dǎo)致胎兒畸形、維生素D攝入過量可能引起低熱驚厥、維生素E攝入過量可能導(dǎo)致出血傾向并影響機(jī)體免疫功能[2]。因此，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地定性定量分析油脂性食品中的維生素 A、D、E能夠?yàn)橛椭允称焚|(zhì)量安全監(jiān)管及油脂抗氧化新工藝研究提供技術(shù)支持[3～5]。我國現(xiàn)行的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)[6～8]，國內(nèi)[9～12]和國外[13～16]的研究表明，目前應(yīng)用最為廣泛的脂溶性維生素A、D、E的測定方法為皂化后液液萃取-液相色譜法，其中僅維生素D有現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法可通過皂化后液液萃取后由質(zhì)譜檢測器檢測結(jié)合內(nèi)標(biāo)法定。皂化后液液萃取法優(yōu)點(diǎn)，一是樣品凈化較為徹底，二是統(tǒng)一了脂溶性維生素的檢測形式；但操作步驟繁雜、耗時(shí)長，無法實(shí)現(xiàn)快速批量檢測，同時(shí)過多的前處理操作環(huán)節(jié)極易影響結(jié)果的精密度。凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）可用于對復(fù)雜基質(zhì)樣品中脂肪、色素和蛋白質(zhì)等大分子干擾物質(zhì)的處理凈化，能夠顯著提高前處理的效率和結(jié)果的精密度[17]。質(zhì)譜檢測作為高靈敏度的定量檢測技術(shù)，十分適用于油脂性食品中脂溶性維生素的精準(zhǔn)定性和定量[18～22]。

本實(shí)驗(yàn)采用 GPC技術(shù)對油脂性食品進(jìn)行自動(dòng)化的前處理，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定脂溶性維生素A、D、E，從而顯著提高油脂性食品中脂溶性維生素檢測方法的分析效率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

乙酸乙酯（色譜純），Merck公司；甲醇（色譜純）、甲酸（優(yōu)級純）、乙酸銨（優(yōu)級純）、視黃醇標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度95%），SIGMA-ALDRICH公司；視黃醇醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度99.9%），Supelco公司；DL-α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度99.0%），Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；維生素D2標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度99.1%），Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；維生素 D3標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度 98.9%），Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

MS205DU電子天平，梅特勒-托利多；Elmasonic S180H超聲儀，Elma Hans Schmidbaner GmbH &Co.KG公司；Preplinc GPC+Accu Vap凝膠凈化滲透色譜儀，J2 Scientific公司；配備紫外檢測器、分離色譜柱PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g）、環(huán)己烷（色譜純），Merck公司；TSQ Quantum Access Max液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo公司；配有電噴霧電離源(ESI)，Thermo Xcalibur質(zhì)譜工作站；Milli-Q Reference超純水器，美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別準(zhǔn)確稱量視黃醇、視黃醇醋酸酯、DL-α-生育酚、維生素D2、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)樣品5 mg、5 mg、10 mg、10 mg、100 mg至10 mL棕色容量瓶中，精確至0.1 mg，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-4 ℃避光儲(chǔ)存。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 凝膠色譜條件

分離色譜柱：PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g）；流動(dòng)相：環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液，流速：5 mL/min，進(jìn)樣量：5 mL；洗脫時(shí)間：（0～15）min、收集流出液時(shí)間：（15～35）min、清洗時(shí)間：（35～45）min。

1.2.2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（2.1 mm×100 mm，粒徑 3 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相：A：甲醇、B：0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序：（0～1）min，50%A；（1～3）min，50%～95%A；（3～9）min，95%A；（9～10）min，95%～50%A；（10～11）min，50%A。

1.2.2.3 質(zhì)譜條件

圖1 各脂溶性維生素MRM色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of fat soluble vitamins

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓：3800 V；霧化器溫度：200 ℃；鞘氣壓力：40 psi；輔助氣：15 psi；毛細(xì)管溫度：350 ℃。

定性離子、定量離子及對應(yīng)的碰撞能量、噴霧電壓參數(shù)見表1。圖1為各脂溶性維生素MRM色譜圖，其中視黃醇出峰時(shí)間為4.00 min，視黃醇醋酸酯出峰時(shí)間為4.48 min，維生素D2出峰時(shí)間為5.92 min，維生素D3出峰時(shí)間為6.00 min，維生素E出峰時(shí)間為6.81 min。

表1 脂溶性維生素的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for fat soluble vitamins

1.2.3 樣品處理

油脂性食品：稱取0.3～0.5 g試樣于10 mL刻度離心管中，在避光條件下，加入環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液定容至10 mL刻度線，渦旋震蕩2 min，提取液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后按照1.2.2.1項(xiàng)方法用凝膠色譜凈化，流出洗脫液濃縮定容到1 mL待分析。

脂溶性維生素混和標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各200 μL于10 mL棕色容量瓶中，在避光條件下混勻后用環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液定容至刻度，提取液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后按照1.2.2.1項(xiàng)方法用凝膠色譜凈化，流出洗脫液濃縮定容1 mL待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GPC分離條件的確定

油脂樣品主要由高級脂肪酸的甘油酯組成，其分子量通常在 800以上，而脂溶性維生素的分子量在250～450之間。GPC技術(shù)是基于空間排阻的原理根據(jù)分子量大小的不同進(jìn)行分離，因此本實(shí)驗(yàn)采用GPC為凈化手段?？赡軐Ψ蛛x效果產(chǎn)生影響的主要因素包括色譜柱類型、柱容量、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相組成和比例。商品化的凝膠滲透色譜柱通常規(guī)定了允許使用的流動(dòng)相組成和比例，故本實(shí)驗(yàn)主要考慮的條件優(yōu)化因素為色譜柱類型、色譜柱容量和流動(dòng)相流速。

理論上，色譜柱容量越大、流動(dòng)相流速越慢越能夠改善混合物的分離度，但實(shí)際操作時(shí)還要考慮檢測工作的時(shí)效性，因此通過交互設(shè)計(jì)，對兩種不同長度的色譜柱在三種流速下分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如下：

（1）以環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液作為流動(dòng)相，選擇兩種常用長度的色譜柱，分離色譜柱1：Express GPC cleanup column（填料質(zhì)量20 g）、分離色譜柱2：PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g），分別比較流速1（5 mL/min）、流速2（3 mL/min）、流速3（2 mL/min）三種不同流速下的脂溶性維生素與大豆油的分離度，在可接受的分離度下比較總分析時(shí)間，選擇合適分離度條件下分析時(shí)間最短的條件作為最佳方案。當(dāng)分離度為0.8時(shí)，相鄰兩組分可達(dá)到95%的分離度，完全滿足凈化油脂的需要，本實(shí)驗(yàn)擬將分離度達(dá)到0.8作為可以接受的分離度。表2為分離度與總分析時(shí)間情況，綜合考慮分離度和總分析時(shí)間指標(biāo)，試驗(yàn)1和試驗(yàn)2的分離度小于0.8，無法滿足凈化油脂的需求，試驗(yàn)3、試驗(yàn)4、試驗(yàn)5、試驗(yàn)6的分離度均大于0.8，且試驗(yàn)4所用分析時(shí)間最短，故選擇試驗(yàn)4為以大豆油為基體分離脂溶性維生素的最佳分離方案。

分離度計(jì)算公式：R=2(t2-t1)/(W1+W2)

注：t2：相鄰兩峰中后一色譜峰的保留時(shí)間；t1：相鄰兩峰中前一色譜峰的保留時(shí)間；W1、W2：此相鄰兩峰的峰寬。

圖2 最佳分離條件下脂溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)樣品和不同油脂樣品的GPC圖譜Fig.2 GPC chromatograms of fat soluble vitamins mixed standard samples and different oil samples at the optimal separation conditions

（2）采用以上最佳分離條件對其他油脂樣品如大豆油、動(dòng)物油（黃油）、維生素 E軟膠囊、魚肝油軟膠囊進(jìn)行分離度的測試，通過試驗(yàn)由圖2可見，脂溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在15 min后流出，而大豆油、動(dòng)物油（黃油）、維生素 E軟膠囊、魚肝油軟膠囊中的油脂成分均在15 min前出峰流出，二者分離度均在0.8以上，結(jié)果表明該條件能夠?qū)⑵渌贩N油脂樣品和脂溶性維生素進(jìn)行很好地分離，滿足實(shí)驗(yàn)需求，故選擇15 min～35 min收集流出液。

表2 分離度與總分析時(shí)間Table 2 Resolution and total analysis time

2.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

分別選擇甲醇-甲酸水和乙腈-甲酸水作為流動(dòng)相，試驗(yàn)表明：當(dāng)以乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，其洗脫能力較強(qiáng)，視黃醇和視黃醇醋酸酯在液相部分難以分離；二者母離子和碎片離子信息完全一致，在質(zhì)譜部分也無法分離；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在乙腈條件下各標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子化程度均受到一定程度的抑制，且維生素 D3無法檢測，以甲醇作為流動(dòng)相時(shí)的檢測靈敏度提高2個(gè)數(shù)量級，且所有脂溶性維生素均可檢測，故選擇以甲醇作為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)為正離子掃描模式，嘗試在流動(dòng)相中加入甲酸、乙酸銨以提高離子化效率及改善峰型，試驗(yàn)表明，0.1%的甲酸、5 mmol/L的乙酸銨體系能提供最佳離子化條件。

2.2.2 離子源選擇

電噴霧離子源（ESI）是最常用的液相離子源，適用于極性較強(qiáng)的化合物，可用于熱不穩(wěn)定化合物的分析大氣壓化學(xué)電離源（APCI）適用于中等極性或弱極性的小分子量化合物，尤其是含雜原子的化合物，不適合熱不穩(wěn)定或在溶液中容易電離的化合物。雖然ESI源是常用的離子源，但由于脂溶性維生素極性較弱，從原理上可能APCI源具有更好的電離效果，故對兩種離子源進(jìn)行對比試驗(yàn)，結(jié)果表明APCI源在分析維生素D2和D3時(shí)比ESI源具有更高的靈敏度，但對維生素A和維生素E的分析不如ESI源，考慮到ESI源的通用性，本實(shí)驗(yàn)選擇ESI源。

2.2.3 母離子確定

視黃醇是一個(gè)具有脂環(huán)的不飽和一元醇，其分子量為286.45，正離子掃描下理論分子離子峰應(yīng)為287，在研究質(zhì)譜方法的過程中，未找到287的母離子。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，脂肪族醇、胺、腈類及多支鏈化合物容易裂解，分子離子峰通常很弱或不出現(xiàn)，因此判斷視黃醇在分析過程中可能發(fā)生了源內(nèi)裂解，分析其分子結(jié)構(gòu)，其容易發(fā)生脫氫重排脫去一分子水，形成質(zhì)荷比為269的脫水峰，經(jīng)試驗(yàn)，證實(shí)了這一判斷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)視黃醇醋酸酯也發(fā)生了同樣的反應(yīng)。

2.3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 方法檢出限和線性范圍取濃度分別為5、20、50、100、200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積A對相應(yīng)的質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明：視黃醇、視黃醇醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E在5～200 μg/L的濃度范圍內(nèi)均

具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均在0.999以上。按3倍信噪比計(jì)算得到樣品中視黃醇、視黃醇醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E的檢出限分別為2

μg/kg、1 μg/kg、5 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg。

2.3.2 方法回收率

在不含有脂溶性維生素的大豆油基質(zhì)中添加脂溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，使大豆油中各脂溶性維生素含量為10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg；由于油脂中普遍含有維生素E，故維生素E回收率采用試劑空白加標(biāo)進(jìn)行測試。

按1.2方法進(jìn)行預(yù)處理，表3為各脂溶性維生素回收率結(jié)果。結(jié)果表明：視黃醇的回收率在97.0%～102.3%；視黃醇醋酸酯的回收率在98.1%～102.3%；維生素D2的回收率在96.3%～106.6%；維生素D3的回收率在96.7%～103.2%；維生素E的回收率在93.1%～99.1%。

表3 各脂溶性維生素回收率結(jié)果Table 3 Results of recoveries of fat soluble vitamins

2.3.3 方法精密度

在不含有脂溶性維生素的大豆油基質(zhì)中添加脂溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，使大豆油中各脂溶性維生素含量為20.0 μg/kg，維生素E采用試劑空白加標(biāo)進(jìn)行測試。

按 1.2方法進(jìn)行預(yù)處理，平行處理 6次，進(jìn)行LC-MS/MS分析，測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明：視黃醇、視黃醇醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：2.77%、1.09%、4.77%、2.13%、2.60%。

表4 脂溶性維生素精密度測試結(jié)果Table 4 Precision of fat soluble vitamins (n=6)

2.4 與皂化后液液萃取-液相色譜法的比較

2.4.1 檢測對象比較

兩種方法在檢測對象上存在差異：皂化-液液萃取法在皂化處理過程中將維生素A、維生素E的酯水解為單體形式，統(tǒng)一了脂溶性維生素的檢測形式，因此無需配備各種酯化標(biāo)準(zhǔn)樣品。GPC為一種物理分離，在凈化過程中不改變維生素的化學(xué)形式，在檢測時(shí)需要了解維生素的添加形式，以選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性定量比較。

2.4.2 檢測方法學(xué)指標(biāo)比較

對凝膠滲透色譜-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（方法一）與皂化-液液萃取液相色譜法（方法二）測定油脂性食品中脂溶性維生素含量方法進(jìn)行比較，方法學(xué)指標(biāo)比較結(jié)果見表 5。結(jié)果表明：方法一與方法二在一定濃度范圍內(nèi)都有較好的線性關(guān)系，但方法一的檢出限、回收率和精密度明顯優(yōu)于方法二。

表5 方法學(xué)指標(biāo)比較結(jié)果Table 5 Comparison of methodology index

2.4.3 檢測效率比較

采用方法一前處理環(huán)節(jié)需要30 min，質(zhì)譜分析時(shí)間為15 min；方法二前處理環(huán)節(jié)需要皂化45 min、冷卻10 min、液液萃取及去除水分環(huán)節(jié)約需45 min、濃縮定容20 min、液相色譜分析時(shí)間為70 min。脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖見圖3。

從單個(gè)樣品總分析時(shí)間比較方法一和方法二單個(gè)樣品凈分析時(shí)間分別為：45 min和170 min；從人力消耗上比較，方法一前處理環(huán)節(jié)可實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化、方法二除皂化過程外均需要人工操作。

圖3 為脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of fat soluble vitamins standard sample

3 結(jié)論

以PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g）作為GPC分離色譜柱，環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液作為GPC流動(dòng)相，流速為5 mL/min分離凈化食用植物油、動(dòng)物脂肪、油脂性保健食品中脂溶性維生素。以0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨水溶液和甲醇作為質(zhì)譜流動(dòng)相，結(jié)合ESI源，在正離子掃描模式條件下，采用LC-MS/MS同時(shí)測定維生素A、D、E含量結(jié)果滿意，該法與皂化液液萃取-液相色譜法測定油脂性食品中維生素 A、D、E含量方法相比具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、自動(dòng)化程度高和分析時(shí)間短等多重優(yōu)勢。