陳玲，楊小鵑，陸永成，尚建鋼，羅之綱，郭偉鵬，吳清平，張菊梅

(1.華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物分析檢測中心,廣東省微生物研究所，廣東廣州 510070）(2.上?？底R食品科技有限公司，上海 201100）

微生物污染是引起食源性疾病的主要因素，長期以來，水傳播病原微生物污染一直是飲水安全的最大威脅，歷史上由水為媒介的傳染病霍亂、傷寒、脊髓灰質(zhì)炎、病毒性肝炎和寄生蟲病等曾奪去千百萬人的生命。盡管現(xiàn)代水消毒處理技術(shù)在一定程度上能夠控制飲水微生物污染，但微生物仍然是水質(zhì)控制的首要問題。包裝飲用水的微生物污染問題是長期困擾生產(chǎn)企業(yè)食品安全的質(zhì)量技術(shù)難題，同時也是每年各省市食品安全監(jiān)管部門重點(diǎn)監(jiān)督抽查的食品安全指標(biāo)。世界衛(wèi)生組織制定的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》第3版中明確提出，無論在發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家，與飲用水有關(guān)的安全問題大多來自微生物。當(dāng)前，飲用水安全在世界各國都被擺在首位，隨著人們關(guān)注度的提高，相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)也在不斷更新。2006年我國制定的生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）中，與GB 5749-1985版相比，水質(zhì)指標(biāo)由35項(xiàng)增至106項(xiàng)，微生物指標(biāo)由2項(xiàng)增至6項(xiàng)，新國標(biāo)符合國際飲用水標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展趨勢。隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和消費(fèi)者飲水習(xí)慣的改變，人們對包裝飲用水的需求量日益增長，對水質(zhì)要求也越來越高，這就要求企業(yè)生產(chǎn)過程中的各個環(huán)節(jié)必須保障飲用水安全，運(yùn)用多重屏障如臭氧、紫外線（UV）照射、反滲透（RO）、過濾及蒸餾等來保障產(chǎn)品微生物安全[1]。目前，國內(nèi)對于包裝飲用水生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的微生物（包括食源性致病菌），缺乏系統(tǒng)的調(diào)查分析和風(fēng)險(xiǎn)識別，本文以分布在A、B、C、D四個市的包裝飲用工廠生產(chǎn)工藝中各環(huán)節(jié)的水為研究對象，對原水、過程水（指超濾水或砂濾水、碳濾水、UV水、RO水）和成品水進(jìn)行微生物檢測，監(jiān)測項(xiàng)目包括菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)，以及銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。同時利用傳統(tǒng)和分子鑒定技術(shù)，對分離到的優(yōu)勢菌進(jìn)行分類鑒定，以掌握背景資料，形成企業(yè)微生物分布圖譜，為產(chǎn)品中污染微生物的溯源和工廠生產(chǎn)過程中微生物質(zhì)量控制提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

圖1 包裝飲用水生產(chǎn)工藝及采樣點(diǎn)Fig.1 Production process and samples layout plans in packaged drinking water company

根據(jù)GB/T 5750.2-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集與保存》進(jìn)行采樣。采集分布在A、B、C、D四個市的包裝飲用工廠內(nèi)的原水、過程水（指超濾水或砂濾水、碳濾水、UV水、RO水）、成品水共33份樣品。工廠生產(chǎn)工藝及采樣點(diǎn)見圖1，該包裝飲用水企業(yè)的原水為市政水，對其進(jìn)行多級凈化處理，最終獲得成品水。

1.1.2 主要試劑與儀器

微生物培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)，API生化鑒定試劑條及其配套試劑購自法國生物梅里埃公司，BIOLOG生化鑒定相關(guān)試劑購自美國BIOLOG公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑購自廣州東盛生物科技有限公司，真菌基因組提取試劑盒購自美國Omega公司，PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成。

滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、PCR儀、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、生物安全柜。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

菌落總數(shù)參照GB/T 5750.12-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》，霉菌和酵母計(jì)數(shù)參照 GB 4789.15-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，大腸菌群計(jì)數(shù)參照GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》，銅綠假單胞菌、糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌參照GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》。

1.2.2 菌種鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[2]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]，分離的優(yōu)勢菌采用 API、BIOLOG生化鑒定系統(tǒng)和PCR方法擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因進(jìn)行菌種鑒定，其中分子方法具體操作步驟：

1.2.2.1 基因組DNA提取

選取樣品培養(yǎng)所得微生物菌落中的優(yōu)勢菌株分離純化后，根據(jù)相應(yīng)基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取。

1.2.2.2 細(xì)菌鑒定方法

采用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)菌株的16S rRNA基因，引物：F27 (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')，R1492 (5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3')；PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，1 min；56 ℃退火，1 min；72 ℃延伸，2 min；共進(jìn)行30循環(huán)；最后72 ℃終延伸，7 min。

1.2.2.3 測序與分析

擴(kuò)增產(chǎn)物交付北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進(jìn)行測序分析。最后將所得測序結(jié)果提交到GENBANK(http：// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)進(jìn)行比對，分析其與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性。

2 結(jié)果與討論

2.1 生產(chǎn)工藝中微生物檢測結(jié)果

共采集33份樣品（A市10份，B市9份，C市和D市各7份），進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)，以及銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測。所有樣品霉菌和酵母計(jì)數(shù)、大腸菌群檢出值均＜1 CFU/mL；砂濾水、碳濾水的菌落總數(shù)檢出值較高，次之為UV水。33份樣品中除了B市的RO水檢出銅綠假單胞菌（檢出值為6 CFU/250 mL）、A市的碳濾水檢出糞鏈球菌（檢出值為 10 CFU/250 mL）；其他樣品銅綠假單胞菌和糞鏈球菌檢出值均為0 CFU/250 mL、產(chǎn)氣莢膜梭菌檢出值均為0 CFU/50 mL。過程水（指超濾水或砂濾水、碳濾水、UV水、RO水）具體檢測結(jié)果見表1，銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果見表2。

由結(jié)果可知，四個工廠原水、超濾水以及成品水的微生物總體風(fēng)險(xiǎn)較低，其中經(jīng)過臭氧工藝后的成品水所檢測的微生物指標(biāo)均未檢出。而碳濾水菌落總數(shù)檢出值較高，水體作為營養(yǎng)物質(zhì)、顆粒物和微生物的載體，在其流動的過程中，微生物利用水體中的有機(jī)物進(jìn)行生長繁殖，最終粘附在管壁上，隨著時間推移，有可能形成生物膜?；钚蕴渴欠N多孔性含炭物質(zhì)，由于它具有發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)和巨大的比表面積，故能有效去除水中有機(jī)污染物，同時為微生物的棲息提供了場所[4]。越來越多研究表明，活性炭出水中微生物的數(shù)量會增加，主要是由于活性炭床上附著大量微生物，這些微生物從炭床脫落進(jìn)入出水，從而使得活性炭出水中的微生物普遍高于其他單元出水的微生物?；钚蕴砍鏊募?xì)菌常與細(xì)小的活性炭顆粒一并流出，受炭粒的保護(hù)，該類細(xì)菌對不良環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性[5]。各種微生物可認(rèn)為是以顆粒狀態(tài)存在，建議工廠采用在線的顆粒計(jì)數(shù)儀定量檢測出水中的顆粒物，通過控制各類顆粒的數(shù)量，保障水的微生物安全性。除此以外，應(yīng)適當(dāng)增加對活性炭的清洗消毒頻率，定期更換活性炭，以免因吸附飽和失去功效。相比碳濾水檢測結(jié)果，UV水菌落總數(shù)檢出值略低，但其帶來的微生物風(fēng)險(xiǎn)，會對后續(xù)水處理工藝中RO膜增加負(fù)荷，降低使用壽命，應(yīng)引起關(guān)注。而在水處理工藝的末端添加了微濾（孔徑≤1 μm）可去除細(xì)菌等顆粒污染物，降低了水體進(jìn)入灌裝區(qū)的微生物風(fēng)險(xiǎn)。

表1 過程水檢測結(jié)果Table 1 Microbiological detection of supply-water

RO水AS7 7 ＜1 ＜1 BS7 ＜1 ＜1 ＜1 CS7 ＜1 ＜1 ＜1 DS7 ＜1 ＜1 ＜1

表2 致病菌檢測結(jié)果Table 2 Microbiological detection of pathogenic bacteria

2.2 菌種鑒定

從四個工廠分離出34株菌株進(jìn)行鑒定，均鑒定為細(xì)菌，未分離到真菌，結(jié)果見表3。分離的34株細(xì)菌中，共包括3個門，16個屬，21個種，4株未鑒定到種，優(yōu)勢種群為食酸菌屬（主要分離自碳濾水和 UV水）、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬和分枝桿菌屬（主要分離自超濾水和UV水）。從屬的水平分析，分離的細(xì)菌主要由食酸菌屬（18.2%）、假單胞菌屬（12.1%）、分枝桿菌屬（12.1%）、芽胞桿菌屬（9.1%），其他占一小部分。分離的34株細(xì)菌中條件致病細(xì)菌有：乙酸鈣不動桿菌（分離自砂濾水）、偶發(fā)分枝桿菌（分離自RO水和超濾水）、銅綠假單胞菌（分離自RO水）、糞鏈球菌（分離自碳濾水），其中不動桿菌屬是非發(fā)酵條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時可引起各種感染如腦膜炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等[6]，偶發(fā)分枝桿菌屬是革蘭氏陽性桿菌，細(xì)胞壁含有分枝菌酸，為胞內(nèi)寄生菌，能引起長期慢性感染，其中偶發(fā)分枝桿菌具有較強(qiáng)的適應(yīng)力、容易引起傷口反復(fù)腐爛[7]。B市工廠的RO水中檢出銅綠假單胞菌，銅綠假單胞菌是一種重要的水源性致病菌，廣泛存在于各類型水中，該菌的生長對營養(yǎng)要求不高，對紫外線、消毒劑、干燥等物理因素及不良環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，不易被殺死[8,9]；它能產(chǎn)生抗藥性，增加感染患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，作為條件致病菌，可能引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥等疾病[10]。本研究團(tuán)隊(duì)魏磊等[11]對全國36家水廠的108份樣本進(jìn)行該菌的檢測，結(jié)果顯示全國山泉水水源水、活性碳過濾后水污染率較高，分別為66.7%、83.3%。除了銅綠假單胞菌，糞鏈球菌在水中的檢出率也很高，Wei L等[12]在314份水中有48份樣品檢出糞鏈球菌，其中碳濾后水的糞鏈球菌污染率最高，為34.5%。本文A市工廠的碳濾水同樣檢出糞鏈球菌，對于如何監(jiān)控分析此類條件致病菌污染原因并進(jìn)行有效控制已成為包裝飲用水生產(chǎn)廠家密切關(guān)注的問題。

表3 菌種鑒定結(jié)果Table 3 Identification of the predominant strains

注：a為未查到中文種名；b為未鑒定到種。

3 結(jié)論

包裝飲用水企業(yè)四個工廠生產(chǎn)工藝對微生物的控制較為有效，微生物危害風(fēng)險(xiǎn)較低。在我國，包裝飲用水微生物污染存在企業(yè)生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，從源頭難以有效控制；且微生物種類多易發(fā)生變異，使得污染控制技術(shù)需不停的調(diào)整和優(yōu)化，以獲得一套有效的車間質(zhì)量監(jiān)測體系。包裝飲用水企業(yè)可參照 GB 19304-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范》的相關(guān)要求，以及該標(biāo)準(zhǔn)附錄A“包裝飲用水加工過程的微生物監(jiān)控程序指南”，進(jìn)行固定頻率的監(jiān)控，各監(jiān)控點(diǎn)的監(jiān)控結(jié)果應(yīng)當(dāng)符合監(jiān)控指標(biāo)的限值并保持穩(wěn)定，當(dāng)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不符合時，應(yīng)立即糾正，同時查找問題原因。除此以外，建議包裝飲用水企業(yè)開展常態(tài)化的微生物監(jiān)控，除了對包裝飲用水生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)的水進(jìn)行監(jiān)控外，還應(yīng)對環(huán)境、人員、設(shè)備和產(chǎn)品包裝材料等進(jìn)行微生物污染調(diào)查和風(fēng)險(xiǎn)識別研究，以獲取完整的微生物風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)；對于重要致病菌的監(jiān)控，企業(yè)可根據(jù)條件引入PCR或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等快速檢測方法。管控產(chǎn)品發(fā)生微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，建立包裝飲用水微生物安全風(fēng)險(xiǎn)和溯源數(shù)據(jù)庫，依據(jù)現(xiàn)有規(guī)程及時糾正，從而建立新型包裝飲用水的質(zhì)量控制體系，提升整個行業(yè)風(fēng)險(xiǎn)控制能力，保證產(chǎn)品安全。