沼澤紅假單胞菌與枯草芽孢桿菌對鯽魚IL-8和IL-10基因表達的影響

方慶，李璟，王利

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.成都理工大學環(huán)境學院，四川 成都 610059）

白細胞介素（interleukin）是指在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，可以傳遞信息，激活、調(diào)節(jié)免疫細胞并介導T、B細胞增殖與分化，在炎癥反應中也起重要作用。IL-8和IL-10是其中的重要組成部分，在炎癥反應和免疫方面發(fā)揮著極其重要的作用[1-2]。IL-8屬于CXC型趨化因子，具有促進炎癥反應與有絲分裂和刺激血管生成等作用，與多種疾病及衰老都有密切的聯(lián)系，在免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤方面也具有極其重要的作用，并且是評價動物免疫功能的重要指標[3]。IL-10作為一種多效價細胞因子在腫瘤、炎癥和免疫性疾病等多種疾病中也發(fā)揮著重要的作用。IL-10在具有免疫抑制作用的同時也具有免疫刺激作用，可以促進B細胞的增殖、分化和MHCⅡ類分子表達，阻止B細胞凋亡，并促進各種免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換和非單核細胞依賴性T細胞的成熟與增殖，是重要的抑制性細胞因子[4]。

枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌是我國農(nóng)業(yè)部第105號公告公布的允許使用的益生菌飼料添加劑，因其具有無抗藥性、適應性強，能耐受高濃度的有機廢水和較強的分解轉(zhuǎn)化能力，不污染環(huán)境等優(yōu)點在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中使用廣泛[5]。目前，已有關IL-8及IL-10的研究多偏重于對腫瘤因子的影響，而關于益生菌對鯽魚相關基因影響的文章鮮有報道。該試驗采用RT-PCR方法，選用沼澤紅假單胞桿菌、復合菌種（枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌）對鯽魚的兩個基因表達的影響的不同狀況，推測益生菌對鯽魚炎癥反應和免疫功能的作用，為深入研究鯽魚免疫應答反應、炎癥發(fā)生及益生菌的推廣使用，提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗中所用枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌，由該試驗室制備培養(yǎng)，經(jīng)分子鑒定后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試驗用鯽魚購于成都某市場，體長（15.7±2.3）cm，體質(zhì)量（115.2±13.8）g。營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar；北京奧博星生物技術有限責任公司）。2×Long Tap Mix酶、DNA Marker DL2000購自北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。Yeast Extract、Tryptone、Trizol（Invitrogen公司產(chǎn)品），凝膠回收試劑盒（Axygen公司產(chǎn)品）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組

選取大小均勻，生長狀況良好的鯽魚90尾，分成3組。A組空白對照組，B組添加沼澤紅假單胞菌，C組添加沼澤紅假單胞菌和枯草芽孢桿菌按照1：1混合制成的復合菌。兩組菌均添加至水中。每隔3天進行菌液的添加，至終濃度活菌量為2.1×107cfu/ml，試驗養(yǎng)殖時間為30 d。試驗每隔10 d，每缸隨機選取3尾鯽魚，采集上述3尾試驗鯽魚的脾臟和腎臟組織，液氮速凍后迅速將樣品放入-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取總RNA及合成cDNA

利用Trizol法提取試驗魚脾臟和腎臟樣品的總RNA[6]，用分光光度計檢測RNA濃度，并使用FastQuant反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將獲得的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的鯽魚IL-8和IL-10基因全序列，以β-actin為內(nèi)參基因。利用Primer Primer 5.0設計引物，并用Oblige 6.0檢驗，序列為：IL-8上游引物 5'-CTTAGAGGACTGGGTGTA-3'，下游引物5'-GTTATCTTCAGGGTTGC-3'。IL-10上游引物5'-GACACCATTCTGCCAACA-3'，下游引物5'-GCGAACTCAAAGGGATT-3'。β-actin上游引物5'-CAAGATGATGGTGTGCCAAGTG-3'，下游引物5'-TCTGTCTCCGGCACGAAGTA-3'。

1.2.3 PCR擴增

PCR 反應體系（25 μL）：dd H2O 10 μL，2×Taq PCR Master Mix 13 μL，上游引物（10μmol/L）0.9 μL，下游引物（10 μmol/L）0.9 μL，cDNA 模板 1.2 μL。PCR 反應程序為：94℃5 min；94℃30 s，適宜TM值30 s，72 ℃ 40 s，共32個循環(huán)；72℃ 5 min。IL-8、IL-10 和β-actin的TM值分別為46℃，52℃和56℃。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，最后在80 V電壓下電泳30 min，觀察結果并凝膠成像系統(tǒng)記錄。

2 結果分析

2.1 總RNA的提取及檢測

經(jīng)凝膠電泳檢測，A組、B組和C組中脾臟和腎臟（10 d、20 d和 30 d）RNA 28S、18 S 條帶單一清晰，分光度計檢測OD260/OD280值在1.8～2.0之間。由此RNA質(zhì)量及完整性較好，符合試驗要求。

2.2 PCR擴增結果

2.2.1 IL-8表達結果

IL-8的序列長度為143 bp，β-actin序列長度為120 bp，由圖1～圖3可知，IL-8在各時間段的不同組織內(nèi)均有表達。在組別上，圖1 IL-8在C組脾臟中表達量比A、B兩組低，在B組腎臟中的表達量比A、C兩組高；圖2 IL-8在各組組織中的表達量無明顯差異；圖3 IL-8在各組組織中均有較高表達。在時間段上，20 d的表達量最低，而30 d的表達量最高。

圖1 IL-8在不同組織中的表達（10 d）

圖2 IL-8在不同組織中的表達（20 d）

圖3 IL-8在不同組織中的表達（30 d）

2.2.2 IL-10表達結果

IL-10的序列長度為146 bp，β-actin序列長度為120 bp。由圖4～圖6可知，IL-10在各時間段的不同組織內(nèi)均有表達。在組別上，圖4 IL-10在C組脾臟和腎臟中表達量均比A、B兩組高；圖5 IL-10在各組組織中的表達量均較低；圖6 IL-10在脾臟中的表達量均無明顯變化，在B、C組腎臟中的表達量均比A組高。在時間段上，20 d的表達量最低，而30 d的表達量最高。

圖4 IL-10在不同組織中的表達（10 d）

圖5 IL-10在不同組織中的表達（20 d）

圖6 IL-10在不同組織中的表達（30 d）

3 討論

益生菌對于提高水產(chǎn)動物的免疫能力和抗體水平的報道已有許多[7]。沼澤紅假單胞菌和枯草芽孢桿菌均屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用菌種，能夠促進魚類的生長和相關免疫。研究發(fā)現(xiàn)向青蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中分別添加硝化細菌制劑、芽孢桿菌制劑及硝化細菌和芽孢桿菌復合菌劑，結果顯示，青蝦平均體質(zhì)量硝化細菌+芽孢桿菌組增長最多，硝化細菌組稍大于芽孢桿菌組，空白組最少[8]。微生物制劑能夠促進腸胃營養(yǎng)成分吸收，從而使黃顙魚的生長加快[9]。魚類飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高團頭魴的可抗氧功能，增強集體的防御能力，進而促進機體健康[10]。在羅非魚飼料中添加沼澤紅假單胞菌，羅非魚死亡率明顯低于對照組，抗病效果顯著[11]。

飼料中添加殼寡糖可以促進青魚IL-8和IL-10基因的表達[12]。雙氣三聯(lián)活菌減少了IL-10KO小鼠的結腸炎癥，降低了促炎細胞因子的分泌[13]。益生菌乳酸菌的脂質(zhì)酸在豬小腸上皮細胞中能降低聚I：c（聚肌胞苷酸）誘導的IL-8的生成，從而抑制病毒致病性炎癥反應[14]，2株乳酸菌抑制Escherichia coli K88對促炎癥因子APRIL分泌的誘導作用并促進Escherichia coli K88感染的腸上皮細胞分泌IL-10[15]。屎腸球菌可以保護腸上皮細胞，并能減弱腸上皮細胞中ETEC（產(chǎn)腸毒素大腸桿菌）誘導的IL-8分泌[16]。該試驗復合菌組（C組）基因IL-8在腎臟和脾臟的表達量明顯高于對照組（A組），說明適當添加復合菌對鯽魚免疫功能的提高有明顯的影響。IL-10在腎臟中表達量高于對照組，說明沼澤紅假單胞菌能提高鯽魚的免疫功能，其作用機理可能與上述機制相似。而基因IL-10在鯽魚脾臟中表達結果相似，可能是因為IL-10在脾臟中自身表達較低，也可能是益生菌對于脾臟中基因的影響不大，或者與不同菌種的有效成分或者作用方式不同有關，也或者與菌種的選擇或益生菌配比比例有關，其根本原因需要進一步研究。

該試驗IL-8基因在B組和C組中的表達量明顯高于對照組。該研究中第20天時B組和C組的IL-8、IL-10基因的表達量明顯低于第10天和第30天，造成這種差異的原因可能與試驗周期長短、溫度應激有關，一定時期內(nèi)使用免疫增強劑反而會使機體免疫功能下降，可能是魚體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)存在一種負反饋機制。因此，有必要研究益生菌的有效免疫期，也可以作為該試驗基因的表達量隨時間改變而有所改變的試驗依據(jù)。

綜上所述，該試驗從基因水平探討了益生菌對鯽魚脾臟和腎臟中IL-8及IL-10基因表達的影響。這為深入研究益生菌對鯽魚免疫機制的影響提供參考，也為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用提供科學資料。