田雪，孫曉軍，劉存霞，黃兵，李玉峰，宋敏訓(xùn)

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250023）

隨著我國(guó)肉鴨養(yǎng)殖的快速發(fā)展，肉鴨各類傳染性疫病也呈逐漸增加趨勢(shì)。除了禽流感、鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨坦布蘇病毒感染等病毒性疫病以外，鴨的細(xì)菌性疾病也同樣威脅著肉鴨生產(chǎn)。目前已知的鴨細(xì)菌類病原包括鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和鴨疫巴氏桿菌等，這些細(xì)菌常?；旌细腥净蛟谄渌≡腥竞笠鹄^發(fā)感染，還能作為條件性致病菌長(zhǎng)期存在于鴨舍環(huán)境中。近年來(lái)，肉鴨關(guān)節(jié)炎發(fā)病較為普遍，病鴨表現(xiàn)跛行甚至癱瘓，主要癥狀為跗關(guān)節(jié)和/或指關(guān)節(jié)腫脹，我們從不同來(lái)源的表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的北京鴨體內(nèi)分離到部分細(xì)菌，通過16s rDNA測(cè)序進(jìn)行了種屬鑒定，并通過動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)其致病性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 試劑 pMD-18T克隆載體購(gòu)自TAKARA公司；PCR擴(kuò)增試劑盒、核酸提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自Axygen公司，酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉等細(xì)菌培養(yǎng)基及其他試劑購(gòu)自上海生工公司。

1.2 引物 參照文獻(xiàn)[1]合成兩對(duì)細(xì)菌16S rDNA通用引物，其中8F和1492R配對(duì)使用，sgF和sgR配對(duì)使用，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均為1.5kb左右，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為：

8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' ；

sgF：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' ；

sgR：5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3' 。

1.3 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 從表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的北京鴨肝臟、脾臟、腦和關(guān)節(jié)液等器官或部位進(jìn)行細(xì)菌分離，分別接種普通LB平板和血清平板，于普通培養(yǎng)箱和二氧化碳培養(yǎng)箱 （5%CO2）37℃培養(yǎng)18～24h，觀察記錄細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài)、顏色等，必要時(shí)進(jìn)行二次純化培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)或純化后的單菌落，涂片進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 藥物敏感試驗(yàn) 將100μl 0.5麥?zhǔn)蠁挝坏募兓壕鶆蛲坎加贛-H藥敏平板上，貼上藥敏紙片后37℃恒溫培養(yǎng) 24h，按照文獻(xiàn)[2]方法判定敏感、中敏或耐藥。

1.5 16S rDNA序列測(cè)定及分析 參照文獻(xiàn)[3]方法提取細(xì)菌基因組作為模板，按照如下比例配制反應(yīng)體系：細(xì)菌基因組模板1～10ng，16S rDNA上下游引物 （10pM） 各 1μl，dNTP（10mM）0.5μl，Taq酶（5U/μl）0.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，補(bǔ)充 去 離子水至 25μl，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5min，95℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 2min，共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳鑒定后，用DNA凝膠回收試劑盒回收陽(yáng)性條帶，克隆至pMD-18T載體，鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定序列提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)以鑒定細(xì)菌種屬。

1.6 動(dòng)物試驗(yàn) 選取12個(gè)代表性分離菌株經(jīng)純化培養(yǎng)后涂布于5%血清瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)18h，將菌苔用玻璃棒刮下，用PBS緩沖液懸浮并稀釋至濃度為1×109CFU/ml待用。65只7日齡健康雛鴨隨機(jī)分成13組，每組5只，其中1～12組分別經(jīng)腿部肌肉注射稀釋后的菌液0.5ml，對(duì)照組腿部肌肉注射PBS緩沖液0.5ml，試驗(yàn)鴨均飼養(yǎng)于隔離器中，每日觀察記錄試驗(yàn)鴨精神狀態(tài)和發(fā)病情況，10d后逐只稱重，剖檢觀察器官病變，并從關(guān)節(jié)和肝臟重新分離細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及鑒定 從不同來(lái)源表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的北京鴨體內(nèi)共分離到細(xì)菌23株，經(jīng)革蘭氏染色觀察，其中20株為革蘭氏陽(yáng)性球菌或桿菌，3株為革蘭氏陰性桿菌，利用Blast將細(xì)菌的16S rDNA序列與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，12個(gè)革蘭氏陽(yáng)性分離菌株屬葡萄球菌屬（Staphylococcus），7個(gè)革蘭氏陽(yáng)性分離菌株屬棒狀桿菌屬 （Corynebacterium），3個(gè)革蘭氏陰性分離菌株屬大腸桿菌屬，另外有1個(gè)分離株Jeotgalicoccus schoeneichii尚不明分類地位，鑒定結(jié)果見表1。

表1 分離菌株鑒定結(jié)果

2.2 藥物敏感試驗(yàn) 結(jié)果顯示，阿莫西林對(duì)分離菌株具有較好的抑制作用，所有菌株均在中敏以上，沒有出現(xiàn)耐藥菌株；其次為阿米卡星，僅有2個(gè)分離菌株對(duì)其表現(xiàn)為低敏；再次為頭孢噻肟，僅有4個(gè)分離菌株對(duì)其表現(xiàn)低敏；抑菌效果較差的藥物是氟苯尼考、阿奇霉素和恩諾沙星，除3個(gè)大腸桿菌分離株對(duì)其敏感以外，其余大多數(shù)分離菌株對(duì)三種藥物均有不同程度耐藥。分離菌株Jeotgalicoccusschoeneichii（D3)僅對(duì)阿莫西林敏感，對(duì)供試的其他藥物均表現(xiàn)為耐藥。3株大腸桿菌除其中2株對(duì)強(qiáng)力霉素表現(xiàn)耐藥以外，對(duì)其他藥物均在中敏以上。其余分離菌株對(duì)供試藥物均表現(xiàn)為不同程度耐藥，結(jié)果見表2。

表2 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

2.3 將 12 個(gè)代表菌 株 （D3、D4、D5、D6、D7、D9、D11、D12、D13、D17、D19 和 D20）培養(yǎng)物接種試驗(yàn)鴨，連續(xù)觀察10d，各組試驗(yàn)鴨精神、采食均正常，未表現(xiàn)跛行或癱瘓等發(fā)病癥狀，各試驗(yàn)組鴨體重與對(duì)照組沒有顯著差異，從關(guān)節(jié)和肝臟也沒有重新分離到接種細(xì)菌。

3 討論

3.1 肉鴨關(guān)節(jié)炎目前在生產(chǎn)中較為常見，種鴨發(fā)病率較高，病鴨多表現(xiàn)跗關(guān)節(jié)或指關(guān)節(jié)等處腫脹，剖檢可見肌腱腫脹、出血，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有積液，甚至有干酪樣物，有的病例可見關(guān)節(jié)軟骨壞死。同時(shí)，病鴨經(jīng)常伴有肝脾腫大，心肌出血，氣囊炎和腸炎等內(nèi)臟病變。一般認(rèn)為，肉鴨關(guān)節(jié)炎多由細(xì)菌感染引起，病原包括金黃色葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和鏈球菌等。但是，從本文的分離情況來(lái)看，除大腸桿菌以外，其他致病菌并未分離到，說明這些細(xì)菌并不是本文病例的致病因素，反而其他葡萄球菌和某些棒狀桿菌分離率較高。本文分離到的葡萄球菌包括松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）、 阿 爾 萊 特 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus arlettae）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii），棒狀桿菌包括停滯棒狀桿菌（Corynebacterium stationis）、乳酪棒狀桿 菌 （Corynebacterium casei）和 （Corynebacterium falsenii）。松鼠葡萄球菌在人、畜以及水生動(dòng)物身上均能發(fā)現(xiàn)，且能夠造成人尿路感染、腦膜炎和豬皮炎、山羊淋巴結(jié)炎等病癥[4-8]。 趙紅利、楊軍等[9，10]報(bào)道從鴨分離到金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、科氏葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌、溶血葡萄球菌和阿涅蒂斯葡萄球菌等共8種葡萄球菌，其中金黃色葡萄球菌對(duì)鴨致病力最強(qiáng)，可以造成多數(shù)試驗(yàn)鴨發(fā)病死亡，其他葡萄球菌僅造成短期食欲和飲水量下降，而無(wú)明顯發(fā)病癥狀。木糖葡萄球菌和阿爾萊特葡萄球菌能夠造成人和動(dòng)物的化膿性感染或慢性感染，但未見在鴨上的分離報(bào)道[11-14]。

棒狀桿菌是人和動(dòng)物皮膚、粘膜等處的常在寄生菌，除少數(shù)成員如白喉棒狀桿菌以外，其他一般被認(rèn)為是條件性致病菌[15，16]，對(duì)于羊、豬等動(dòng)物而言，某些棒狀桿菌可以造成淋巴結(jié)腫大以及內(nèi)臟的出血和化膿癥狀[17，18]。棒狀桿菌在自然環(huán)境中分布較為廣泛，在雞、鴨等家禽腸道、糞便及禽舍中也能夠分離到[19-21]，Mohan等[22]曾報(bào)道從多發(fā)性關(guān)節(jié)炎病雞中分離到疑似棒狀桿菌，但未見鴨感染棒狀桿菌的報(bào)道。

除以上葡萄球菌、棒狀桿菌和部分大腸桿菌以外，我們還分離到一株Jeotgalicoccus schoeneichii，該菌為革蘭氏陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢的球菌，Glaeser等[23]報(bào)道曾從豬舍的廢氣中分離到該菌，可能是環(huán)境中的常在細(xì)菌。肉鴨關(guān)節(jié)炎病因較為復(fù)雜，除細(xì)菌性因素外，其他病原如呼腸孤病毒、支原體以及霉菌毒素等也可能造成發(fā)病。雖然動(dòng)物試驗(yàn)顯示以上分離菌單獨(dú)對(duì)鴨沒有致病作用，但這些細(xì)菌作為條件性致病菌，在應(yīng)激、霉菌毒素中毒或其他病原混合感染的情況下，有可能作為協(xié)同因素使病情更加嚴(yán)重。

3.2 由于我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)是從低水平粗放型養(yǎng)殖模式逐步發(fā)展而來(lái)，從業(yè)者為了預(yù)防和控制各類疫病而頻繁大量使用藥物，造成細(xì)菌性病原耐藥性嚴(yán)重。從表2可以看出，23個(gè)菌株針對(duì)供試藥物具有不同程度的耐藥性，其中對(duì)氟苯尼考具有耐藥性的有18個(gè)菌株，對(duì)強(qiáng)力霉素和恩諾沙星具有耐藥性的各有15個(gè)菌株，對(duì)阿奇霉素具有耐藥性的有12個(gè)菌株，抑菌效果相對(duì)較好的藥物是頭孢噻肟和阿米卡星，各有4個(gè)和2個(gè)耐藥菌株，抑菌效果最好的藥物是阿莫西林，對(duì)所有分離菌株均在中敏以上。耐藥性最強(qiáng)的分離菌株為Jeotgalicoccusschoeneichii，該菌對(duì)供試的7種藥物中的6種均不敏感。雖然細(xì)菌耐藥性和致病性之間并不存在直接聯(lián)系，但耐藥性會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌的適應(yīng)性，引起更加嚴(yán)重的感染，提高治療的難度和成本，還有可能通過食物鏈傳遞給人，造成公共衛(wèi)生隱患。家禽養(yǎng)殖場(chǎng)中細(xì)菌耐藥性的形成無(wú)疑與藥物的濫用有關(guān)，為了解決這個(gè)問題，除了有選擇地合理用藥以外，還應(yīng)當(dāng)積極改變養(yǎng)殖模式，通過衛(wèi)生和消毒措施減少細(xì)菌性病原的感染幾率。

3.3 細(xì)菌核糖體RNA亞基按照沉降系數(shù)分為5S、16S和23S三種，16S rDNA是編碼16S亞基的基因，該基因序列中具有多個(gè)保守區(qū)和可變區(qū)，可以根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)出針對(duì)所有細(xì)菌的通用引物，又可以根據(jù)可變區(qū)的差異區(qū)分不同種屬的細(xì)菌，因此16SrDNA作為一種有效的分子標(biāo)記，逐步被應(yīng)用到細(xì)菌的分類鑒定和遺傳分析中。通過對(duì)16S rDNA的PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定和比對(duì)即可確定細(xì)菌分類地位，特別是對(duì)于一些難以分離和純化的細(xì)菌而言，相對(duì)于生化試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)、工作量較大的缺陷，這種方法具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但部分細(xì)菌由于種間差異較小，僅僅利用16S rDNA測(cè)序不能鑒定到種，這種情況下仍需要利用生化試驗(yàn)或16S～23S rDNA間隔序列分析進(jìn)行確定。本文利用16S rDNA分析鑒定了23株鴨源分離菌，與GenBank中相近菌株的同源性為88%～100%，說明本方法可用于快速確定細(xì)菌的屬種，是細(xì)菌學(xué)分析的有力工具。