蘋果砧木組培苗的脫毒與檢測(cè)

宋正旭，馬榮群，黃粵

（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島 266100）

蘋果是多年生木本植物，生長過程中會(huì)遭受多種病毒的侵染，使得樹體生長勢(shì)減弱，直接影響產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重地可造成植株死亡。目前危害較嚴(yán)重的病毒種類主要有蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）、蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）、蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）以及蘋果銹果類病毒屬（Apscaviroid）等[1]。種植無病毒苗木是防治病毒病的最根本途徑，本試驗(yàn)對(duì)課題組優(yōu)選的13個(gè)蘋果砧木資源進(jìn)行病毒脫除處理，并檢測(cè)脫毒效果，以期為生產(chǎn)提供更多無病毒蘋果砧木優(yōu)良苗木。

1 材料與方法

1.1 供試材料

課題組保存的蘋果品種及砧木材料：HCT-1、HCT-2、E、M26-1、M26-2、TM7-1、JM7-2、BP、H0、ME-2、W8N13、71-3-150、唐木田共13份材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脫毒處理方法

于4、5月份大田植株旺盛生長期，取快速生長的新梢，室內(nèi)消毒，在超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖鏡下剝?nèi)?～2mm的莖尖接種于分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)莖尖分化成苗，分化出的植株經(jīng)增殖培養(yǎng)獲得大量繼代苗，將在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d左右的瓶苗放入培養(yǎng)箱進(jìn)行變溫?zé)崽幚?，培養(yǎng)條件為38℃光照8h，32℃黑暗下16h，培養(yǎng)40d后切取莖尖于繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，成苗后進(jìn)行病毒檢測(cè)[2]。

1.2.2 病毒檢測(cè)

脫毒處理后的組培苗參考郝璐等[3]的方法進(jìn)行病毒檢測(cè)。共檢測(cè) 13 個(gè)樣品，HCT-1、HCT-2、E、M26-1、M26-2、TM7-1、JM7-2、BP、H0、ME-2、W8N13、71-3-150和唐木田。

檢測(cè)方法：共對(duì)13個(gè)蘋果樣品采樣進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的病毒為 ASGV、ASPV、ACLSV、Apscaviroid。采用 SiO2吸附法提取RNA，Random Primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié)果與分析

圖1 內(nèi)參基因及4種病毒、類病毒的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of intrinsic reference genes and 4 viruses

由圖1及表1（見下頁）可知，第8、11、13號(hào)材料含有ASGV；第2、8、11號(hào)材料含有ACLSV；第10號(hào)材料含有Apscaviroid。即BP、W8N13、唐木田含有蘋果莖溝病毒；HCT-2、BP、W8N13 含有蘋果褪綠葉斑病毒；ME-2 含有蘋果銹果類病毒；所檢樣品均未檢出蘋果莖痘病毒。蘋果品種E、M26、JM7、H0和71-3-150等砧木通過春季旺盛生長期取材結(jié)合莖尖培養(yǎng)即可脫除所攜帶的病毒，這可能因?yàn)榇杭竟麡渫⑸L期新梢的生長速度遠(yuǎn)高于病毒繁殖的速度，使得頂芽新梢部位不含病毒或病毒含量極少，再結(jié)合莖尖培養(yǎng)技術(shù)，即可脫除絕大部分病毒。材料HCT莖尖培養(yǎng)獲得再生植株依然攜帶ACLSV，進(jìn)一步進(jìn)行高溫處理即可將ACLSV脫除干凈，而唐木田和ME莖尖培養(yǎng)結(jié)合高溫處理仍有部分病毒不能脫除。

表1 供試材料中四種病毒類病毒的攜帶情況Table 1 Portability of four viruses in the test materials

由此可見，取材時(shí)期對(duì)蘋果病毒的脫除效果影響極大，后期的高溫處理對(duì)于病毒的進(jìn)一步脫除也有一定的貢獻(xiàn)。上述四種病毒，蘋果莖痘病毒相較其他三種病毒更易脫除，而供試材料E、M26、JM7、H0和71-3-150等蘋果砧木更易獲得無病毒植株。

3 結(jié)論

種植無病毒苗木是防治果樹病毒病的最根本途徑，本試驗(yàn)對(duì)課題組現(xiàn)有蘋果砧木資源進(jìn)行病毒脫除并檢測(cè)脫毒效果，結(jié)果顯示，使用RT-PCR檢測(cè)脫毒處理后樣品 BP、W8N13、唐木田含有 ASGV；HCT-2、BP、W8N13 含有ACLSV；ME-2含有Apscaviroid；所檢樣品均未檢出ASPV。試驗(yàn)獲得5份無病毒蘋果砧木組培苗。此外，試驗(yàn)還得出，蘋果莖痘病毒相較其他三種病毒更易脫除，而供試材料E、M26、JM7、H0和71-3-150等蘋果砧木更易獲得無病毒植株。